柑橘類果皮提取物對蕎麥立枯絲核菌的抑制作用

江 蘭， 趙江林*， 湯 燾， 李 興， 鐘靈允， 袁 健， 趙 鋼

(1.成都大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雜糧加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610106；2.西昌市正中食品有限公司，四川 西昌 615000)

蕎麥為蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬(Fagopyrum)雙子葉植物，是一種著名的特色雜糧作物。蕎麥含有蛋白質(zhì)、氨基酸、不飽和脂肪酸、維生素和礦質(zhì)微量元素，還富含生物黃酮、D-手性肌醇、γ-氨基丁酸等活性功能成分[1-4]。研究表明，蕎麥及其制品在預(yù)防和輔助治療高血壓、高血脂、糖尿病，增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗氧化、防衰老，以及改善亞健康狀態(tài)等方面具有較好功效[1,5]。近10年來，隨著我國蕎麥種植面積的不斷擴(kuò)大，蕎麥病害的發(fā)生也呈逐年加重趨勢，其中，由立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKühn)引起的蕎麥立枯病害導(dǎo)致蕎麥爛種、爛芽、缺苗斷壟或幼苗萎蔫枯死等[6]，可致蕎麥年產(chǎn)量損失達(dá)15%以上，且降低蕎麥的品質(zhì)[7-8]；其分泌產(chǎn)生多種對人畜有害的代謝物和毒素，直接或間接對農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全構(gòu)成極大威脅[9]。目前，生產(chǎn)上主要以噴施多菌靈、福美雙、代森鋅及克菌丹等農(nóng)藥進(jìn)行防治，但長期使用這些化學(xué)藥劑又易使病原菌的抗性增強(qiáng)，生成農(nóng)藥殘留及環(huán)境污染等[7]，因此，急需開發(fā)低毒、高效、低殘留且環(huán)境友好型的植物源殺菌劑替代這些化學(xué)農(nóng)藥，對保障食品安全，促進(jìn)我國蕎麥產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。

柑橘為蕓香科(Rutaceae)柑橘亞科柑橘屬(Citrus)植物。我國柑橘資源十分豐富，是世界上第一大種植國。柑橘在加工生產(chǎn)過程中通常有30%～45%的皮渣副產(chǎn)物生成[10]。研究發(fā)現(xiàn)，柑橘皮渣中富含黃酮類化合物、類檸檬苦素及揮發(fā)油等多種功能性成分，其具有較好的抗菌、殺蟲、抗氧化、抗病毒和消炎等生物活性[11-15]，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用價值。迄今為止，尚未見有關(guān)于柑橘類果皮提取物對蕎麥立枯絲核菌抑制活性的研究報道?；诖?，采用菌絲生長速率法研究了6種代表性柑橘類果皮提取物對蕎麥立枯絲核菌菌絲生長的抑制作用，以期篩選出具有較好抑菌活性的提取物，為柑橘屬植物果皮的開發(fā)利用及蕎麥立枯病等病害新型植物源防治藥劑的開發(fā)研制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 病原菌菌株 蕎麥立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani，Rs-1)，由成都大學(xué)-農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雜糧加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 柑橘 蜜柚(CitrusgrandisOsbeck)、臍橙(CitrussinensisOsbeck)、椪柑(CitrusreticulataBlanco cv.Ponkan)、檸檬(CitruslimonBurm.f.)、不知火〔Citrusreticulata×(C.reticulata×C.sinenesis)〕、沙糖橘(Citrusreticulatacv. Shiyueju)，市售。

1.1.3 試劑 多菌靈(Aldrich公司)、95%乙醇(成都市科隆化學(xué)品有限公司)、瓊脂粉(成都市科龍化工試劑廠)、無水葡萄糖(成都市科龍化工試劑廠)，市售。

1.1.4 儀器與設(shè)備 DHP-9160B智能型恒溫培養(yǎng)箱，上海朗玗實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；JJ-CJ-1FD潔凈臺，蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司；R-20旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申順生物科技有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州澳華儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料預(yù)處理

1) PDA培養(yǎng)基的制備。稱取洗凈去皮的馬鈴薯200.0 g，切粒，加水1000 mL煮沸至爛，紗布過濾后收集汁液，再加入葡萄糖20.0 g和瓊脂20.0 g，攪拌加熱至瓊脂粉完全溶解，加水定容至1 000 mL，搖勻后分裝到錐形瓶內(nèi)，封口，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，備用。

2) 菌株活化。試驗(yàn)前將蕎麥立枯絲核菌接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上，置于28.5℃恒溫培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)，暗培養(yǎng)3～5 d。

3) 柑橘類果皮提取物的制備。分別將6種柑橘果皮切成1 cm2(1 cm×1 cm)小塊，熱水回流2 h，過濾除雜，收集上清液。然后分別將制備果皮水提物后剩余的濾渣按照1∶1.2(m/v)的料液比加入95%乙醇，在室溫下浸提1周，過濾除雜，收集上清液。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對2種上清液分別進(jìn)行濃縮，近干后轉(zhuǎn)入50～55℃的烘箱中烘干至恒重，即得柑橘類果皮水提物和醇提物。將其密封保存于4℃冰箱內(nèi)備用。

4)帶毒平板制備。用分析天平分別稱取6種柑橘果皮水提物各0.2 g、0.4 g、0.8 g和1.2 g，依次加入到50 mL的PDA中，制備成濃度為4.0 mg/mL、8.0 mg/mL、16.0 mg/mL和24.0 mg/mL的水提物帶藥培養(yǎng)基；另用分析天平分別稱取6種柑橘果皮醇提物各0.1 g、0.2 g和0.3 g，依次加入到50 mL的PDA中，制備成濃度為2.0 mg/mL、4.0 mg/mL和6.0 mg/mL的醇提物帶藥培養(yǎng)基。將各水提物和醇提物帶藥培養(yǎng)基倒皿，冷卻后備用。

1.2.2 提取物對立枯絲核菌菌絲生長的抑制作用 采用菌絲生長速率法(mycelia growth rate)檢測各提取物對蕎麥立枯絲核菌菌絲生長的抑制作用[1]。在培養(yǎng)皿中央移入已活化好的蕎麥立枯絲核菌菌餅(Φ=7 mm )，每皿1個，3 次重復(fù)。以蒸餾水為空白對照(CK)，5 μg/mL多菌靈為陽性對照(CK+)。隨后將培養(yǎng)皿倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待空白對照平板菌絲長滿平皿的90%時，采用十字交叉法測量菌落直徑，并計算抑制率。

抑制率=[(溶劑對照菌落拓展直徑-處理菌落拓展直徑)/溶劑對照菌落拓展直徑]×100%

1.2.3 提取物對蕎麥立枯絲核菌菌絲生長抑制中濃度(IC50)的測定 選取對蕎麥立枯絲核菌菌絲生長抑制活性較強(qiáng)的4種提取物(沙糖橘醇提物、蜜柚醇提物、椪柑醇提物和檸檬醇提物)，進(jìn)一步測定其IC50。將各提取物分別配制為沙糖橘醇提物(0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、4.0 mg/mL和6.0 mg/mL)、蜜柚醇提物(1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、4.0 mg/mL、6.0 mg/mL和8.0 mg/mL)、椪柑醇提物(1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、3.0 mg/mL、6.0 mg/mL和9.0 mg/mL)和檸檬醇提物(1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、4.0 mg/mL、6.0 mg/mL和8.0 mg/mL)的帶藥培養(yǎng)基，活性測定方法同上。將提取物濃度(μg/mL)換算成濃度對數(shù)(X)，抑制率換算成生物統(tǒng)計幾率值(Y)，并求得其相關(guān)回歸方程Y=aX+b ，根據(jù)線性方程求IC50。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010和SPSS 20.0對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 柑橘類果皮水提物對蕎麥立枯絲核菌菌絲生長的抑制作用

從圖1和圖2看出，6種柑橘果皮水提物對蕎麥立枯絲核菌菌絲生長均具有一定的抑制作用，但整體活性較弱；隨著處理濃度升高，6種柑橘果皮水提物的抑制作用均呈增強(qiáng)趨勢，菌落直徑逐漸減小，抑菌圈逐漸增大；濃度為4.0～24.0 mg/mL時，果皮水提物的抑制率為17.5%～61.5%。其中，椪柑和沙糖橘果皮水提物的抑制活性相對較強(qiáng)，濃度為24.0 mg/mL時，其提取物對蕎麥立枯絲核菌菌絲生長的抑制率分別為61.5%和59.3%，二者差異不顯著；該濃度下椪柑果皮水提物的抑制活性顯著高于其余果皮水提物，沙糖橘果皮水提物的抑制活性顯著高于除蜜柚外的其余果皮水提物。

注：A，沙糖橘；B，蜜柚；C，不知火；D，椪柑；E，臍橙；F，檸檬；CK，水；CK+，5 μg/mL多菌靈；A～F的濃度單位為mg/mL。Note: A，C.reticulata cv.Shiyueju; B，C.grandis; C，C.reticulate×(C.reticulate×C.sinenesis); D，C.reticulata Blanco cv.Ponkan; E，C.sinensis; F，C.limon; CK，water; CK+，5 μg/mL Carbendazim;Concentration unit，mg/mL.

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。Note: Different lowercase letters indicate significance of difference at P<0.05 level.The same below.

2.2 果皮醇提物對立枯絲核菌菌絲生長的抑制作用

由表1可見，6種柑橘果皮醇提物對蕎麥立枯絲核菌菌絲的生長均有一定的抑制作用，其活性大小與提取物類別及處理濃度有關(guān)；隨著處理濃度升高，6種柑橘果皮醇提物的抑制率均呈升高趨勢。其中，沙糖橘果皮醇提物對蕎麥立枯絲核菌菌絲

表1 6種柑橘果皮醇提物對蕎麥立枯絲核菌菌絲生長的抑制率Table 1 Inhibitory rate of ethanol extracts from six citrus fruits’ peels against mycelia growth of R.solani of buckwheat

生長的抑制率最高，蜜柚、檸檬和椪柑果皮醇提物的抑制活性次之。沙糖橘果皮醇提物濃度為2.0～6.0 mg/mL時對蕎麥立枯絲核菌菌絲生長的抑制率為70.0%～75.2%，處理間無顯著差異，但均顯著高于除陽性對照外的其余處理。當(dāng)處理濃度為6.0 mg/mL時，沙糖橘、蜜柚、檸檬和椪柑果皮醇提物對蕎麥立枯絲核菌菌絲生長的抑制率分別為75.2%、66.0%、60.1%和57.3%；不知火和臍橙果皮醇提物的抑制作用相對較弱，其抑制率分別為40.8%和43.7%。

2.3 果皮醇提物對立枯絲核菌生長的抑制中濃度

6種柑橘果皮醇提物對蕎麥立枯絲核菌菌絲生長的抑制活性較相應(yīng)水提物的抑制作用強(qiáng)，其中，沙糖橘、檸檬、蜜柚和檸檬等4種柑橘的果皮醇提物對蕎麥立枯絲核菌菌絲生長的抑制活性相對較強(qiáng)。因此，選用4種醇提物進(jìn)一步測定其對蕎麥立枯絲核菌菌絲生長的抑制中濃度(IC50)。從圖3和圖4可知，隨著供試濃度的增加，4種柑橘果皮醇提物對蕎麥立枯絲核菌菌絲生長的抑制效果均呈上升趨勢，菌落直徑逐漸減小，抑菌圈逐漸增大；在供試濃度范圍內(nèi)，沙糖橘、蜜柚、椪柑和檸檬的果皮醇提物對蕎麥立枯絲核菌Rs-1的抑制作用呈一定的量效關(guān)系，經(jīng)擬合得到4種柑橘果皮醇提物的濃度-抑制活性曲線分別為Y沙糖橘=1.210 6x+1.233 9(R2=0.907 6)、Y蜜柚=0.899 5x+2.018 2(R2=0.946 2)、Y椪柑=1.038 0x+1.284 7(R2=0.998 3)和Y檸檬=0.827 1x+2.179 8(R2=0.988 9)，表明，其濃度與活性之間的線性關(guān)系良好(R≥0.952 7)。由此計算得到4種醇提物對蕎麥立枯絲核菌菌絲生長的IC50分別為沙糖橘1.29 mg/mL，蜜柚2.07 mg/mL，檸檬2.57 mg/mL和椪柑3.80 mg/mL。表明，沙糖橘醇提物對蕎麥立枯絲核菌的抑制作用最強(qiáng)，其次為蜜柚、檸檬和椪柑醇提物。

注：A，沙糖橘；B，蜜柚；C，椪柑；D，檸檬；CK，水；CK+，5 μg/mL多菌靈；A～D的濃度單位為mg/mL。Note: A，C.reticulata cv.Shiyueju; B，C.grandis; C，C.reticulata Blanco cv.Ponkan; D，C.limon; CK，water; CK+，5 μg/mL Carbendazim; Concentration unit，mg/mL.

圖4 沙糖橘、蜜柚、椪柑和檸檬果皮醇提物對蕎麥立枯絲核菌的抑制活性Fig.4 Inhibitory activity of different ethanol extracts from peels of C.reticulata cv.Shiyueju,C.Grandis,C.reticulata Blanco cv.Ponkan and C.Limon against mycelia growth of R.solani of buckwheat

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，6種柑橘果皮提取物對蕎麥立枯絲核菌菌絲生長均具有一定的抑制效果，其活性大小與供試濃度呈正相關(guān)關(guān)系，且其果皮醇提物對蕎麥立枯絲核菌的抑制作用均較相應(yīng)水提物的強(qiáng)。在供試濃度為6.0 mg/mL時，沙糖橘果皮醇提物對蕎麥立枯絲核菌菌絲生長的抑制效果最好，其抑制率達(dá)75.2%；蜜柚、檸檬和椪柑果皮醇提物的活性次之，其抑制率分別為66.0%、60.1%和57.3%；不知火和臍橙果皮提取物對蕎麥立枯絲核菌的抑制活性相對較弱。沙糖橘、蜜柚、檸檬和椪柑等4種柑橘果皮醇提物對蕎麥立枯絲核菌菌絲生長的抑制中濃度(IC50)分別為1.29 mg/mL、2.07 mg/mL、2.57 mg/mL和3.80 mg/mL，具有較高的開發(fā)利用價值。后期將對這些提取物中抑菌活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征、抑菌作用機(jī)制、田間防治效果及活性成分的提取制備工藝等方面進(jìn)行進(jìn)一步深入研究，進(jìn)而為蕎麥立枯病新型防治藥劑的開發(fā)研制和柑橘皮附加值的提升奠定基礎(chǔ)。