中華根瘤菌NP1中反硝化基因啟動(dòng)子分析及熒光定量PCR驗(yàn)證

張 宇, 王 森, 陳度宇, 許 雷

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院, 北京 100081

好氧反硝化菌是一類在有氧條件下能夠進(jìn)行脫氮反應(yīng)的異養(yǎng)微生物，自Robertson和Kuene[1]在20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)了好氧反硝化菌Thiosphaerapantotropha、Pseudomonassp.和Alcaligenesfaecalis等之后，此類脫氮菌被陸續(xù)報(bào)道。迄今為止，已從各種環(huán)境中篩選得到許多不同種屬的具有好氧反硝化功能的菌株，如在廢水處理系統(tǒng)中分離獲得施氏假單胞菌PseudomonasstutzeriSU2[2]、在稻田沉積物中分離獲得反硝化產(chǎn)堿菌AlcaligenesdenitrificansT25[3]以及在糞便處理系統(tǒng)中分離獲得枯草芽胞桿菌Bacillussubtilis[4]等。

在好氧條件下，反硝化作用主要涉及4個(gè)關(guān)鍵酶, 分別是周質(zhì)硝酸鹽還原酶NAP、亞硝酸鹽還原酶NIR、一氧化氮還原酶NOR和氧化亞氮還原酶NOS。周質(zhì)硝酸鹽還原酶NAP在好氧時(shí)表達(dá)占主導(dǎo)，能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽還原酶再將亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為NO氣體，一氧化氮還原酶對NO具有較高的親和力，能夠?qū)O還原為N2O，最后氧化亞氮還原酶能將NO、N2O兩種氣體同時(shí)還原為N2。

目前，好氧反硝化菌廣泛應(yīng)用于廢水生物處理池作用于廢水生物脫氮[5]，使硝化與反硝化在同一個(gè)反應(yīng)器中進(jìn)行，進(jìn)而大量減少了占地面積，降低成本。然而，大氣中的N2O濃度持續(xù)上升，其中很大一部分來自微生物。目前對于N2O生成的機(jī)理及原因的認(rèn)識還不夠全面。一種觀點(diǎn)認(rèn)為氧氣濃度會影響N2O還原酶的活性，低溶解氧條件下N2O會取代N2成為反硝化的最終產(chǎn)物[6]。還有觀點(diǎn)認(rèn)為C/N、DO濃度、SRT(污泥停留時(shí)間) 都會影響N2O的累積，導(dǎo)致釋放量增加[7]。

按照控制轉(zhuǎn)錄水平的高低，啟動(dòng)子可以分為強(qiáng)啟動(dòng)子和弱啟動(dòng)子。啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄水平上起到重要作用，不僅決定了基因的表達(dá)水平，而且決定了基因表達(dá)的時(shí)空順序[8～10]，啟動(dòng)子作為指導(dǎo)基因起始轉(zhuǎn)錄的重要順式元件，在很大程度上決定了基因的轉(zhuǎn)錄速率，從而影響基因的表達(dá)效率[11,12]。

本文對中華根瘤菌NP1中反硝化關(guān)鍵酶基因的啟動(dòng)子進(jìn)行生物信息學(xué)分析，初步預(yù)測了反硝化基因啟動(dòng)子的強(qiáng)弱，進(jìn)一步利用熒光定量PCR對中華根瘤菌NP1反硝化基因的相對轉(zhuǎn)錄水平差異進(jìn)行比較，最后通過直接測量反硝化過程中相關(guān)代謝產(chǎn)物的含量進(jìn)行驗(yàn)證，從而為揭示反硝化過程中N2O的釋放提供了一種合理解釋。

1 材料與方法

1.1 啟動(dòng)子序列分析

從中華根瘤菌NP1的全序列中獲得周質(zhì)硝酸鹽還原酶NAP、亞硝酸鹽還原酶NIR、一氧化氮還原酶NOR和氧化亞氮還原酶NOS基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游3 000 bp至轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游的+1 000 bp序列，共計(jì)4 000 bp的這段序列包含潛在的基因啟動(dòng)子序列。綜合利用BPROM(http://www.softberry.com/berry.phtml)、Tfsitescan(http://www.ifti.org/cgi-bin/ifti/Tfsitescan.pl)、NNPP(Neural Network Promoter Prediction，http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)等啟動(dòng)子預(yù)測網(wǎng)站，通過在線分析得到預(yù)測的nap、nir、nor和nos4個(gè)基因的啟動(dòng)子序列位置及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子序列。

1.2 供試菌株

Sinorhizobiumsp. NP1為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 培養(yǎng)基

反硝化培養(yǎng)基：KNO30.72 g/L，琥珀酸鈉2.17 g/L，維氏鹽溶液50 mL/L，pH 7.0～7.5。

維氏鹽溶液：K2HPO45 g/L，NaCl 2.5 g/L，MgSO42.5 g/L，F(xiàn)eSO40.05 g/L，MnSO40.05 g/L。

1.4 試劑

細(xì)菌RNA小提試劑盒購自O(shè)MEGA公司、SYBR?Premix ExTaqTM(Perfect Realtime)和PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real-time) 均購自TaKaRa公司。引物合成為上海生工生物技術(shù)有限公司完成。Realtime-PCR反應(yīng)八連管及管蓋購自美國Axygen公司。

1.5 生長曲線的測定

將單菌落接種于20 mL以KNO3為單一氮源的反硝化培養(yǎng)基中，每隔3 h取樣，使用分光光度計(jì)測定OD600值，繪制36 h內(nèi)NP1的生長曲線。

1.6 總RNA的提取及cDNA的合成

將NP1單菌落接種于20 mL反硝化培養(yǎng)基中，30℃ 180 r/min震蕩培養(yǎng)至OD600約為1.5 h，按1%的接種量接種于新的20 mL反硝化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20 h和30 h后分別取1 mL菌液10 000 r/min離心2 min收集菌體，使用RNA提取試劑盒提取RNA，提取的RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。使用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.7 熒光定量PCR反應(yīng)檢測

根據(jù)NP1菌株的4個(gè)反硝化基因序列設(shè)計(jì)其Realtime-PCR特異引物，包括周質(zhì)硝酸鹽還原酶基因nap(登錄號：KR902902)、亞硝酸鹽還原酶基因nir(登錄號：FJ598613)、一氧化氮還原酶基因nor(登錄號：KR902903)、氧化亞氮還原酶基因nos(登錄號：KR080373)，采用16S rRNA為內(nèi)標(biāo)基因，所用引物見表1。

熒光定量PCR的反應(yīng)混合液(25 μL)：12.5 μL SYBR?Premix ExTaqⅡ染料，1μL引物F，1μL引物R，2μL模板cDNA和8.5μL雙蒸水。 PCR 循環(huán)條件為：95℃預(yù)變性2 min；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。

為減少實(shí)驗(yàn)差異，內(nèi)標(biāo)基因與目的基因每個(gè)樣品分別設(shè)3個(gè)平行重復(fù)，試驗(yàn)結(jié)果取平均值。采用相對定量方法[13]表示各目的基因nap、nir、nor、nos的表達(dá)量。計(jì)算ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因和ΔΔCt=ΔCt待測組-ΔCt對照組，2-ΔΔCt即表示目的基因相對于對照基因的表達(dá)倍數(shù)[14]。測定以KNO3為單一氮源培養(yǎng)20 h和30 h后的NP1菌樣中相關(guān)反硝化基因轉(zhuǎn)錄水平的相對量進(jìn)行驗(yàn)證，其中每個(gè)樣品相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的變化以20 hnor基因的轉(zhuǎn)錄水平作為對照來表示。

1.10 N2O氣體含量的測定

N2O氣體含量測定采用氣相色譜法[18]。將1 mL菌液接種于含有100 mL反硝化培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，瓶口用滅過菌的橡膠塞塞緊，保持裝置氣密性良好，搖床30℃ 180 r/min震蕩培養(yǎng)，一段時(shí)間后采用5 mL注射器抽取錐形瓶內(nèi)的氣體注入氣相色譜儀的進(jìn)樣口。N2O的測定采用氣相色譜儀(Agilent 7890)，進(jìn)樣口溫度120℃，檢測器溫度280℃，以純度為99.99%，流速為30 mL/min的高純氮?dú)庾鳛檩d氣，保留時(shí)間2 min[19]。

表1 熒光定量PCR所用引物序列Table 1 Primer sequences for real-time PCR.

2 結(jié)果與分析

2.1 中華根瘤菌NP1反硝化基因啟動(dòng)子分析

BPROM細(xì)菌啟動(dòng)子預(yù)測程序能夠預(yù)測由Sigma70啟動(dòng)子調(diào)控的細(xì)菌基因的潛在轉(zhuǎn)錄起始位置，啟動(dòng)子識別的準(zhǔn)確性約為80%，同時(shí)預(yù)測到-10區(qū)和-35區(qū)啟動(dòng)子核心序列相應(yīng)的間隔堿基數(shù)分布信息，并給出了對應(yīng)的線性判別函數(shù)(linear discriminant function,LDF)預(yù)測得分。

中華根瘤菌NP1反硝化基因的啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，硝酸鹽還原酶基因、亞硝酸鹽還原酶基因、一氧化氮還原酶基因和氧化亞氮還原酶基因分別使用各自的啟動(dòng)子，即4個(gè)反硝化基因并不位于同一個(gè)操縱子，而是分別行使功能。涉及的每個(gè)啟動(dòng)子的強(qiáng)度如表2所示，可以看出，nap和nir基因的啟動(dòng)子強(qiáng)度相對更高，據(jù)此猜測，周質(zhì)硝酸鹽還原酶和亞硝酸鹽還原酶的表達(dá)量要高于一氧化氮還原酶和氧化亞氮還原酶，并在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證。

圖1 Sinorhizobium sp. NP1反硝化基因啟動(dòng)子預(yù)測圖示Fig.1 The predicted promoters annotation of Sinorhizobium sp. NP1 denitrifying genes.

基因-35區(qū)-10 區(qū)啟動(dòng)子效率napTCGTCACCGTATAAT83%nirTTGAAACTTTATAAT91%norTTGTCGGGCTGTCAT66%nosTTCTCGCGCTCTACT58%

2.2 菌株NP1生長曲線

通過1.5中的方法測定菌株NP1的生長曲線，結(jié)果如圖2所示，菌株NP1在反硝化液體培養(yǎng)基中生長較為緩慢，12 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，對數(shù)生長期持續(xù)時(shí)間較長， 24 h后進(jìn)入平臺生長期，達(dá)到最大OD600值約1.5。

2.3 熒光定量PCR檢測反硝化基因的表達(dá)差異

通過1.6中的方法，提取NP1菌株的總RNA，結(jié)果如圖3所示。對提取出的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄， 用1.7中的方法對反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進(jìn)行熒光定量PCR。

圖2 菌株NP1生長曲線Fig.2 The growth curve of stain NP1.

圖3 RNA提取電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of RNA extraction.

通過熒光定量PCR技術(shù)，采用相對定量方法分析中華根瘤菌NP1的4個(gè)反硝化基因nap、nir、nor、nos在不同時(shí)期表達(dá)水平的差異，每個(gè)基因的擴(kuò)增曲線均為典型的S型曲線，溶解曲線主峰單一且無雜峰，排除了非特異性擴(kuò)增，經(jīng)2-△△Ct法對目的基因做相對定量分析后結(jié)果如圖4所示?？梢詮闹锌闯?，在以KNO3為單一氮源的培養(yǎng)條件下，無論在20 h對數(shù)期還是在30 h平臺期，4個(gè)反硝化關(guān)鍵基因的表達(dá)并不同步。周質(zhì)硝酸鹽還原酶基因和亞硝酸鹽還原酶基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于一氧化氮還原酶基因和氧化亞氮還原酶基因，前者比后者的表達(dá)量高出將近一倍，這將導(dǎo)致氧化亞氮還原酶無法將全部NO和N2O還原為N2，造成N2O氣體的殘留并釋放到大氣中污染環(huán)境。

圖4 NP1菌株不同時(shí)期反硝化基因的表達(dá)差異Fig.4 Expression differences of denitrifying genes in different stages of NP1.

2.4 NP1菌株反硝化代謝產(chǎn)物分析

以KNO3為單一氮源培養(yǎng)NP1菌株，對其反硝化產(chǎn)物進(jìn)行測定，結(jié)果如圖5所示，從圖5中可以看出反硝化過程主要發(fā)生在生長旺盛的5～15 h，曲線較陡表示硝態(tài)氮濃度有明顯變化，在前20 h硝態(tài)氮濃度隨著時(shí)間增加而減少，之后趨于穩(wěn)定，硝態(tài)氮濃度在30 h內(nèi)從初始200.00 mg/L下降到97.31 mg/L，下降很快，證明NP1菌株中周質(zhì)硝酸鹽還原酶活性較高。

圖5 以KNO3為單一氮源培養(yǎng)NP1菌株時(shí)硝態(tài)氮消耗情況Fig.5 Nitrate consumption in NP1 cultured with KNO3 as a single nitrogen source.

如圖6所示，亞硝態(tài)氮隨著硝態(tài)氮的減少而逐步積累，當(dāng)硝態(tài)氮反應(yīng)完全時(shí)，亞硝態(tài)氮在15 h達(dá)到最大積累量僅為0.305 mg/L，之后緩慢下降，亞硝態(tài)氮積累逐步降低。亞硝態(tài)氮產(chǎn)生量極低說明亞硝酸鹽還原酶活性很高，并未造成亞硝態(tài)氮的大量積累。

圖6 以KNO3為單一氮源培養(yǎng)NP1菌株時(shí)亞硝態(tài)氮的積累情況Fig.6 Nitrite accumulation in NP1 cultured with KNO3 as a single nitrogen source.

由圖7可知，NP1菌株反硝化過程中N2O的產(chǎn)生量隨著時(shí)間延長而快速增加，最大積累量達(dá)到274 μg/m3，之后達(dá)到平穩(wěn)。說明NO還原酶的活性較低，使得還原產(chǎn)物N2O氣體產(chǎn)生積累，相當(dāng)一部分N2O沒能反應(yīng)完全至生成N2。

圖7 以KNO3為單一氮源培養(yǎng)N2O菌株時(shí)硝態(tài)氮的積累情況Fig.7 N2O accumulation in NP1 cultured with KNO3 as a single nitrogen source.

3 討論

從圖1可以看出在NP1菌株中反硝化基因使用的不是同一個(gè)啟動(dòng)子，這與傳統(tǒng)理論中認(rèn)為細(xì)菌的4個(gè)反硝化基因由同一個(gè)啟動(dòng)子調(diào)控不同，表2的啟動(dòng)子強(qiáng)度分析表明在nap和nir基因發(fā)揮功能后，由于nor和nos基因的啟動(dòng)子強(qiáng)度較弱，導(dǎo)致N2O和NO氣體在還原為N2前被釋放。這一發(fā)現(xiàn)解釋了NO2和NO氣體的釋放機(jī)理，進(jìn)而為解決這一環(huán)境問題提供了理論依據(jù)。

通過熒光定量PCR對中華根瘤菌NP1的反硝化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的差異進(jìn)行了比較，結(jié)果證明在NP1反硝化過程中，一氧化氮還原酶基因和氧化亞氮還原酶基因的表達(dá)量低于周質(zhì)硝酸鹽還原酶基因和亞硝酸鹽還原酶基因，進(jìn)而在分子水平驗(yàn)證了反硝化基因的不同步表達(dá)，也證明了上述對于反硝化基因啟動(dòng)子強(qiáng)度的預(yù)測合理。同時(shí)對反硝化中間代謝產(chǎn)物含量的測定也表明，以KNO3為單一氮源培養(yǎng)NP1時(shí)，確實(shí)有一定量的N2O氣體釋放，推測是由于氧化亞氮還原酶基因的啟動(dòng)子較弱，致使其表達(dá)量降低，無法將產(chǎn)生的全部N2O還原，使其釋放到空氣中造成污染。

1992年，Khalil等[20]對N2O的全球產(chǎn)生源估測研究中表明每年污水處理過程中釋放約0.3～3.0 Tg，占N2O總釋放量的2.5%～25%。2009年，Kampschreur等[21]研究實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的脫氮過程發(fā)現(xiàn)最高有近90%的氮轉(zhuǎn)化為N2O釋放，研究實(shí)際規(guī)模的污水脫氮過程發(fā)現(xiàn)最高近14.6%的氮轉(zhuǎn)化為N2O。Tsuneda等[22]研究實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的利用硝化活性污泥處理人工污水時(shí)發(fā)現(xiàn)N2O的釋放量占總氮的0.7%～13%。

調(diào)查表明N2O的溫室效應(yīng)約是CO2的300倍[21]，N2O的釋放量正在以每年3%的速度持續(xù)上升，對于全球溫室效應(yīng)的貢獻(xiàn)率已達(dá)5%～6%[23]。N2O的大量釋放會引起酸雨，破壞臭氧層[24]。因此，在利用微生物進(jìn)行污水處理的過程中N2O的釋放應(yīng)引起足夠的重視。在反硝化過程中，N2O作為中間產(chǎn)物出現(xiàn)，通常認(rèn)為其是不完全反硝化作用的產(chǎn)物[25]。

通過上述分析，未來可以采用基因工程的手段改造反硝化相關(guān)酶的表達(dá)從而減少N2O的釋放，將硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶、一氧化氮還原酶、氧化亞氮還原酶串聯(lián)在受同一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子調(diào)控的操縱子上，在亞硝酸鹽還原為NO和N2O后直接還原為無害的N2釋放到空氣中。同時(shí)也提供了一種篩選高效固氮菌的重要參考指標(biāo)，以獲得釋放少量N2O的固氮菌。綜上，降低N2O排放到環(huán)境中引起的二次污染，減少溫室效應(yīng)，建立更加高效綠色的污水脫氮工藝，同時(shí)有效控制溫室氣體的排放，具有重大的社會、環(huán)境和經(jīng)濟(jì)意義。