蒺藜苜蓿MtFVE基因功能初步解析

王瑞良, 張鵬程, 牛麗芳, 朱 昊, 李學(xué)森, 王興春*, 林 浩*

1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 山西 太谷 030801;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081;3.新疆畜牧科學(xué)院草業(yè)研究所, 烏魯木齊 830000

開花是高等植物實現(xiàn)世代交替的重要環(huán)節(jié)。植物開花時間受到復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，就模式植物擬南芥而言，主要包括6條途徑，分別為赤霉素途徑(gibberellin)、光周期途徑(photoperiod)、春化途徑(vernalization)、年齡途徑(age)、溫度途徑(temperature)及自主途徑(autonomous)等[1]。自主途徑是指在缺少外源環(huán)境因素(如日照長度、溫度等)的刺激誘導(dǎo)下，植物通過感受自身內(nèi)部的生長發(fā)育情況，在營養(yǎng)生長達(dá)到一定程度時，實現(xiàn)開花的一條途徑。自主途徑調(diào)控開花不受外界環(huán)境因素影響，獨(dú)立于光周期途徑及春化途徑[2]。目前，有研究報道，擬南芥中與自主通路相關(guān)的基因主要有16個，分別為FCA、FY、FPA、cleavagestimulationfactor64(CstF64)、CstF77、Pcf11p-similarprotein4(PCFS4)、GRP7、GRP8、PRP8、PRP39-1、SR45、FLK、LD、CDKC;2、FVE和FLD。根據(jù)推測的生物學(xué)功能，將其分為3大類，即RNA加工、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及組蛋白修飾等[3]。

FLOWERING LOCUS VE(FVE)，是哺乳動物視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白RbAp46/RbAp48的同源物，具有保守的WD40蛋白基序和組蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域[4]。7個WD40蛋白基序折疊成特有的β螺旋槳形式，利于各種蛋白質(zhì)之間以及蛋白質(zhì)和DNA之間的相互作用[5]。研究表明，F(xiàn)VE是擬南芥自主途徑中重要的組成成員，不同處理條件(如長短日照、溫度)下，擬南芥fve突變體均呈現(xiàn)晚花，而在擬南芥中過表達(dá)水稻OsFVE基因出現(xiàn)早花[6]。由此可見，F(xiàn)VE基因在調(diào)控擬南芥開花過程中具有十分重要的作用。FVE調(diào)控擬南芥開花主要通過表觀遺傳學(xué)機(jī)制介導(dǎo)下游基因FLOWERINGLOCUSC(FLC)染色質(zhì)組蛋白修飾的改變，從而抑制FLC轉(zhuǎn)錄。FLC編碼1個MADS-box轉(zhuǎn)錄因子，是典型的開花抑制因子，擬南芥中過表達(dá)FLC基因突變體出現(xiàn)晚花表型。研究表明，在fve突變體中，F(xiàn)LC染色質(zhì)組蛋白H3乙?；胶虷3K4甲基化水平增加[7]。因而，染色質(zhì)修飾的表觀遺傳調(diào)控在FLC基因的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)方面具有十分重要的意義。

組蛋白乙?；谌旧|(zhì)重塑和基因表達(dá)調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用，主要發(fā)生在H3、H4的N端比較保守的賴氨酸位置上，經(jīng)組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferases，HATs)和組蛋白去乙?；?histone deacetylases，HDACs或HDAs)共同調(diào)節(jié)[8]。通常，組蛋白去乙?；种苹虮磉_(dá)，而組蛋白高度乙酰化與基因的轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)。在真核生物中，組蛋白去乙?；钢饕譃?個家族：RPD3/HDA1(reduced potassium dependence 3/histone deacetylase 1)、SIR2(silent information regulator 2)和HD2(histone deacetylase 2)等[9]。就模式植物擬南芥而言，RPD3/HDA1家族的HDACs可進(jìn)一步分為3類：I類包括HDA19、HDA6、HDA7和HDA9；II類包括HDA5、HDA15和HDA18；III類僅包括HDA2[10]。目前，大多數(shù)關(guān)于植物I類HDACs的研究主要集中在HDA6和HDA19上[11]。HDA6和HDA19被各種轉(zhuǎn)錄因子募集并形成多種蛋白質(zhì)復(fù)合物，這些復(fù)合物參與植物的各種發(fā)育過程，如植物開花發(fā)育等。

FLOWERING LOCUS D(FLD)，是擬南芥中人類lysine-specific demethylase 1(LSD1)的同源物，F(xiàn)LD可以使組蛋白H3K4去甲基化。除FLD外，擬南芥中還存在3個LSD1的同源基因，將其命名為LSD1-like基因，分別為LDL1、LDL2、LDL3[12]。在擬南芥中，F(xiàn)VE蛋白與HDA6蛋白和FLD蛋白均能發(fā)生互作。FVE基因調(diào)控開花主要通過FVE與HDA6和FLD形成蛋白復(fù)合體，介導(dǎo)FLC染色質(zhì)組蛋白H3去乙?；胶虷3K4去甲基化水平增加，進(jìn)而導(dǎo)致FLC基因沉默[13]。

蒺藜苜蓿為一年生草本植物，二倍體(2n=16條染色體)，具有基因組小、自花授粉、結(jié)實率高、遺傳轉(zhuǎn)化相對容易且具有Tnt1插入突變體庫等特點(diǎn)，被一致認(rèn)為是新興的豆科模式植物[14]。然而，蒺藜苜蓿中缺失了FLC的同源基因[15]。因此，自主途徑FVE同源基因及其他自主通路成員如何調(diào)控蒺藜苜蓿開花的分子機(jī)制有待探索。

本研究首先通過生物信息學(xué)方法篩選到蒺藜苜蓿中2個與擬南芥FVE基因高度同源的基因MtFVEa和MtFVEb，通過分子生物學(xué)方法，初步解析了MtFVEa和MtFVEb基因的功能，并通過酵母雙雜實驗進(jìn)一步探索MtFVEa蛋白與MtFLD和MtHDA6蛋白的互作情況。本研究旨在為揭示蒺藜苜蓿自主途徑開花調(diào)控分子機(jī)制提供新的思路及參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗材料 蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)野生型R108由實驗室提供。將蒺藜苜蓿種子經(jīng)3%次氯酸鈉消毒5 min，用無菌水清洗5次，置于浸濕的2片濾紙夾層中，于25℃、黑暗條件下萌發(fā)。將萌發(fā)的種子播種于濕潤的營養(yǎng)土中，放置在溫度為24℃、濕度為65%、光強(qiáng)為380 μmol/m2·s、光周期為16 h (光)/8 h (暗)的人工氣候室中進(jìn)行種植培養(yǎng)。

1.1.2實驗試劑 2×TaqPCR Mix購于北京艾德萊生物科技有限公司；TRIzol試劑和焦炭酸二乙酯(DEPC)、酵母雙雜試劑盒均購于美國Invitrogen公司；營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基購自美國Clontech公司；DNA限制性內(nèi)切酶購自美國NEB公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TransScript-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix)和實時熒光定量試劑盒(Trans Tip Green q-PCR SuperMix)均購于北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech)有限公司；快速質(zhì)粒小提試劑盒和DNA純化回收試劑盒均購于天根生化科技(北京)有限公司；pGADT7(Prey)和pGBKT7(Bait)載體均由本實驗室提供。

1.1.3實驗儀器 5424R/5702R/5430R臺式冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)、PCR擴(kuò)增儀(杭州博日科技有限公司)、Light Cycler 96型實時熒光定量PCR擴(kuò)增儀(瑞士Roche公司)、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)、天能凝膠成像系統(tǒng)1600(上海天能科技有限公司)和D7100照相機(jī)(日本尼康公司)。引物合成及樣品測序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 蒺藜苜蓿MtFVE、MtFLD和MtHDA6蛋白序列分析

從TAIR網(wǎng)站上分別下載擬南芥FVE、FLD和HDA6蛋白序列。將擬南芥FVE蛋白序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中與其他物種進(jìn)行蛋白同源比對，分析篩選與擬南芥FVE蛋白同源性較高的不同物種的蛋白序列。獲得的FVE同源序列經(jīng)ClustalW比對后，利用MEGA5軟件在Bootstrap置信值為1 000的條件下構(gòu)建FVE及其同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹。使用BioEdit蛋白序列分析軟件對FVE和蒺藜苜蓿MtFVE進(jìn)行蛋白序列比對分析。將擬南芥FLD、HDA6蛋白在NCBI數(shù)據(jù)庫中分別與蒺藜苜蓿數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源比對，獲得高度同源的蛋白，全長蛋白序列經(jīng)ClustalW比對，然后通過MEGA5軟件(Bootstrap Repeat=1 000)和BioEdit蛋白序列分析軟件分別獲得FLD、HDA6蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹和序列比對結(jié)果。

1.3 熒光實時定量qRT-PCR

收集蒺藜苜蓿野生型R108不同組織部位，分別為生長28 d植株的根、生長40 d植株的莖、生長50 d植株的未展開復(fù)葉和完全張開的花、授粉后7 d的果莢及營養(yǎng)生長28 d的莖尖，用于檢測MtFVEa和MtFVEb基因(蒺藜苜蓿中擬南芥FVE的同源基因)的組織表達(dá)特異性。通過Trizol法提取以上收集的各個組織的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作步驟合成cDNA第一條鏈。以反轉(zhuǎn)錄成的cDNA鏈為模板，用基因特異性引物按照實時熒光定量試劑盒的操作方法進(jìn)行qRT-PCR檢測(特異性引物參見表1)。qRT-PCR體系(10 μL)：qPCR SuperMix 5 μL，模板cDNA 3 μL，正、反向引物(2 μmol/L)各1 μL。qRT-PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性5 s，60℃退火15 s，72℃延伸20 s，共40個循環(huán)。以上均以蒺藜苜蓿體內(nèi)組成型MtActin為內(nèi)參進(jìn)行歸一化處理，用2-△△Ct計算方法對實驗結(jié)果進(jìn)行分析。

1.4 半定量RT-PCR實驗

將1.3步驟中獲得的cDNA第一條鏈作為模板，通過半定量RT-PCR檢測MtFVEa和MtFVEb基因在野生型R108不同組織中的表達(dá)特異性，MtActin為內(nèi)參(特異性引物參見表1)。

PCR體系(10 μL)：2×TaqMix 5 μL，模板cDNA 1 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL，ddH2O 3 μL。PCR反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性2 min；98℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸1 min；72℃再延伸2 min；24℃保存1 min。其中，MtActin基因擴(kuò)增28個循環(huán)，MtFVEa基因為26個循環(huán)，MtFVEb基因為30個循環(huán)。

1.5 酵母雙雜交實驗

通過外切酶Ⅲ連接轉(zhuǎn)化方法將MtFVEa和MtFVEb基因的CDS分別構(gòu)建到pGADT7 (Prey)載體上，獲得pGADT7-MtFVEa、pGADT7-MtFVEb獵物質(zhì)粒。通過外切酶Ⅲ連接轉(zhuǎn)化方法將MtFLD和MtHDA6基因的CDS分別構(gòu)建到pGBKT7 (Bait)上，獲得pGBKT7-MtFLD、pGBKT7-MtHDA6誘餌質(zhì)粒。反應(yīng)體系(10 μL)：NEBuffer 1 1 μL，外切酶Ⅲ(10 000 U/mL)1 μL，DNA(載體和片段)8 μL，其中載體和片段的體積視情況而定。反應(yīng)程序：70℃ 20 min，42℃ 10 min。酶切所用的引物及酶見表2。將以上質(zhì)粒pGADT7-MtFVEa和pGADT7-MtFVEb分別與pGBKT7-MtFLD、pGBKT7-MtHDA6組合共轉(zhuǎn)化酵母Golden Yeast菌株，涂布在營養(yǎng)缺素培養(yǎng)基上于28℃培養(yǎng)箱內(nèi)生長2～3 d，觀察酵母的生長情況，拍照并整理結(jié)果。

表1 引物名稱及序列Table 1 Primers used in the experiment.

表2 酵母雙雜載體構(gòu)建引物及所用的限制性內(nèi)切酶Table 2 Primers and enzymes used in the yeast double-hybrid assay.

1.6 文中涉及相關(guān)基因?qū)?yīng)的基因序列號

MtActin(Medtr3g095530)、MtFVEa(Medtr2g-039250)、MtFVEb(Medtr2g100090)、MtFLD(Medtr1g050535)、MtHDA6-1(Medtr3g077160)、MtHDA6-2(Medtr3g077120)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒺藜苜蓿MtFVE蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

為了在蒺藜苜蓿中尋找與擬南芥FVE同源的蛋白，將擬南芥FVE蛋白序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)在蒺藜苜蓿中存在2個同源蛋白，將其分別命名為MtFVEa和MtFVEb。DNAMAN軟件分析發(fā)現(xiàn)MtFVEa和MtFVEb與擬南芥AtFVE的氨基酸序列一致性分別為78%和63%，MtFVEa與MtFVEb的氨基酸序列一致性為66%。隨后利用MEGA5軟件構(gòu)建了FVE同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1)，分析表明蒺藜苜蓿MtFVEa與AtFVE的親緣關(guān)系較MtFVEb更近。

2.2 蒺藜苜蓿MtFVE蛋白序列比對

使用BioEdit蛋白序列分析軟件將MtFVEa和MtFVEb蛋白與擬南芥AtFVE蛋白進(jìn)行序列比對，分析發(fā)現(xiàn)這2種蛋白均與擬南芥AtFVE蛋白高度同源(圖2)，且均具有保守的WD40結(jié)構(gòu)域，表明MtFVE可能具有與擬南芥FVE類似的功能。

圖1 MtFVE蛋白與不同物種FVE蛋白的進(jìn)化樹分析Fig.1 Phylogenetic tree of MtFVE protein and the FVE proteins from different plant species.

2.3 蒺藜苜蓿MtFVE基因的組織表達(dá)模式分析

目前，MtFVEa和MtFVEb基因在蒺藜苜蓿中的生物學(xué)功能尚不清楚，為了探索MtFVEa和MtFVEb的功能，首先通過半定量RT-PCR和熒光定量PCR分析MtFVEa和MtFVEb基因在蒺藜苜蓿野生型R108不同組織部位的表達(dá)模式。2種實驗結(jié)果均表明MtFVEa和MtFVEb基因在根、莖、葉、花、果莢及莖尖部位均有不同程度的表達(dá)(圖3)，且在花和莖尖中表達(dá)水平較高。由此推測MtFVE基因可能在花和莖尖中具有特異性功能，參與蒺藜苜蓿開花調(diào)控過程。

2.4 蒺藜苜蓿MtFLD蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫蛋白序列比對發(fā)現(xiàn)，蒺藜苜蓿中也相應(yīng)存在6個擬南芥LSD1-like的同源蛋白。用全長蛋白序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖4所示，Medtr1g050535與擬南芥AtFLD的親緣關(guān)系最近，命名為MtFLD。進(jìn)一步通過DNAMAN軟件分析發(fā)現(xiàn)MtFLD與AtFLD氨基酸序列一致性為65%。

圖2 MtFVE與AtFVE蛋白序列比對Fig.2 Protein sequence alignment of MtFVE and AtFVE.

圖3 MtFVEa和MtFVEb基因組織表達(dá)模式分析Fig.3 Gene expression of MtFVEa and MtFVEb in different tissues of M. truncatula R108.

圖4 LSD1-like近緣蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree of LSD1-like proteins.

2.5 蒺藜苜蓿MtFLD蛋白序列比對

使用BioEdit蛋白序列分析軟件進(jìn)一步分析，結(jié)果如圖5所示，蒺藜苜蓿MtFLD蛋白與擬南芥AtFLD蛋白高度同源，均具有保守的SWIRM結(jié)構(gòu)域和組蛋白去甲基化結(jié)構(gòu)域。其中，SWIRM結(jié)構(gòu)域在形成染色質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物的過程中介導(dǎo)特定的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用；組蛋白去甲基化結(jié)構(gòu)域在染色質(zhì)組蛋白修飾過程中發(fā)揮作用。

2.6 蒺藜苜蓿MtHDA蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫蛋白序列比對發(fā)現(xiàn)，蒺藜苜蓿中RPD3/HDA1家族的I類組蛋白去乙?；缚偣灿?個成員。全長蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析(圖6)顯示與HDA6最近緣的蛋白有2個，將其分別命名為MtHDA6-1和MtHDA6-2，其中MtHDA6-1蛋白與AtHDA6具有73%的氨基酸序列一致性，而MtHDA6-2蛋白與AtHDA6僅有27%的一致性。MtHDA6-1蛋白與MtHDA6-2具有37%的氨基酸序列一致性。

2.7 蒺藜苜蓿MtHDA6蛋白序列比對

經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫分析，MtHDA6-1基因的全長為6 234 bp，開放閱讀框為1 431 bp，可編碼477個氨基酸；MtHDA6-2基因的全長為763 bp，開放閱讀框為579 bp，可編碼193個氨基酸。AtHDA6蛋白C端從第333位氨基酸到第471氨基酸負(fù)責(zé)與其他蛋白互作，該區(qū)域天冬氨酸的富集程度較高。如圖7所示，MtHDA6-1與AtHDA6氨基酸序列一致性程度較高，且C端從對應(yīng)于AtHDA6蛋白第333位氨基酸算起，氨基酸序列一致性為56%。而MtHDA6-2則總共編碼193個氨基酸，C端不存在，推測其可能沒有與其他蛋白互作的功能，因此后續(xù)實驗重點(diǎn)關(guān)注MtHDA6-1。

2.8 酵母雙雜實驗檢測MtFVE與MtFLD、MtHDA6-1之間的蛋白相互作用

為了探索擬南芥中FVE與FLD、HDA6的互作是否在蒺藜苜蓿中具有保守性，通過酵母雙雜實驗，發(fā)現(xiàn)MtFVEa分別與MtFLD和MtHDA6-1互作(圖8A)，而MtFVEb未與2個蛋白發(fā)生互作(圖8B)，表明在蒺藜苜蓿中MtFVEa同MtFLD及MtHDA6-1的互作具有保守性。而MtFVEb未檢測到互作的原因還需進(jìn)一步研究。

3 討論

開花時間是高等植物從營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的重要生物學(xué)特征，受到多種環(huán)境因素與遺傳網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控，適時開花影響植物繁殖發(fā)育及產(chǎn)量效益。擬南芥自主途徑[16]和春化途徑[17]基因均通過抑制下游FLC基因的表達(dá)進(jìn)一步調(diào)控開花。FLC編碼1個MADS-box轉(zhuǎn)錄因子，主要通過負(fù)調(diào)控下游基因FLOWERINGLOCUST(FT)及SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCO1(SOC1)的表達(dá)來抑制開花。FLC基因的表達(dá)受到表觀遺傳調(diào)節(jié)，且這種調(diào)節(jié)響應(yīng)于內(nèi)外源環(huán)境的變化[18]。FVE是自主途徑重要的組成成員，具有WD40蛋白基序和組蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，WD40蛋白參與高等植物許多細(xì)胞生命活動，尤其可通過介導(dǎo)染色質(zhì)組蛋白修飾的表觀遺傳調(diào)控進(jìn)一步影響基因轉(zhuǎn)錄[19]。在擬南芥中，F(xiàn)VE分別與FLD和HDA6發(fā)生蛋白互作，且形成多蛋白復(fù)合體介導(dǎo)下游的FLC染色質(zhì)組蛋白修飾，從而抑制FLC基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致fve突變體晚花。HDA6可與FLD直接互作，促進(jìn)擬南芥開花。與fve突變體類似，hda6、fld突變體均呈現(xiàn)晚花表型[20]。由此可見，擬南芥中FVE-FLD-HDA6形成三元蛋白復(fù)合體在染色質(zhì)水平抑制FLC基因表達(dá)進(jìn)一步調(diào)控開花時間。

圖5 MtFLD與AtFLD蛋白序列比對Fig.5 Protein sequence alignment of MtFLD and AtFLD.

圖6 RPD3/HDA1家族Ⅰ類近緣蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.6 Phylogenetic tree of class Ⅰ RPD3/HAD1 proteins.

圖7 MtHDA6與AtHDA6蛋白序列比對Fig.7 Protein sequence alignment of MtHDA6 and AtHDA6.

圖8 酵母雙雜檢測MtFVE與MtFLD及MtHDA6-1的蛋白互作Fig.8 Detection the interaction between MtFVE and MtFLD or MtHDA6-1.

本研究發(fā)現(xiàn)在蒺藜苜蓿中存在FVE、FLD和HDA6的同源蛋白，并且酵母雙雜交結(jié)果顯示MtFVEa與MtFLD和MtHDA6存在蛋白互作。然而，蒺藜苜蓿中缺失開花關(guān)鍵抑制因子FLC的同源基因[15]，因此這個三元復(fù)合體在蒺藜苜蓿中具體的直接作用位點(diǎn)值得后續(xù)深入研究。如在擬南芥中春化通路基因VERNALIZATION2(VRN2)編碼核定位的鋅指蛋白，是Polycomb Group Repressive Complex 2(PRC2)的成員之一，通過組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化(H3K27me3)介導(dǎo)FLC的表達(dá)沉默，VRN2基因的突變表現(xiàn)為晚花[21]。但在蒺藜苜蓿中，VRN2同源基因MtVRN2的功能缺失突變體表現(xiàn)為早花，在mtvrn2突變體中FT同源基因MtFTa1的表達(dá)量上升，且mtvrn2-mtfta1雙突變體表型與mtfta1突變體相似，呈現(xiàn)晚花。然而在mtvrn2突變體中MtFTa1組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化(H3K27me3)水平與野生型相似，表明MtVRN2作為一個開花抑制子可能并不直接抑制MtFTa1的表達(dá)[15]。

因此，后續(xù)研究中需要詳細(xì)分析MtFVE、MtFLD和MtHDA6等基因功能缺失突變體的表型，以及研究蒺藜苜蓿自主途徑基因MtFVE的開花調(diào)控機(jī)制，從而尋找其作用的直接靶位點(diǎn)。同時，需要進(jìn)一步解析在蒺藜苜蓿中是否同樣以FVE-FLD-HDA6三元蛋白復(fù)合體的形式在染色質(zhì)水平上抑制下游基因的表達(dá)來調(diào)控苜蓿的開花時間，從而為蒺藜苜蓿開花時間調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供新的研究思路。