益生菌復(fù)合發(fā)酵酸奶的工藝優(yōu)化及其抗氧化性研究

秦楠，金婕妤，張芹仙，杜嬌

（山西中醫(yī)藥大學(xué)制藥與食品工程學(xué)院，太原030619）

0引 言

酸奶作為發(fā)酵型乳制品，不僅可以促進(jìn)腸道消化、降低膽固醇，還可改善乳制品的風(fēng)味和質(zhì)地[1-2]。益生菌酸奶在改善人體腸道菌群分布和乳糖的代謝方面發(fā)揮著重要作用[3]。

北芪菇是平菇添加黃芪培育而成的一種新型食用菌，其營養(yǎng)價(jià)值更高，尤其硒含量較普通平菇提高15%[4]。具有抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、抗氧化、改善和預(yù)防心腦血管疾病、調(diào)節(jié)免疫，有助于胃腸運(yùn)動、促進(jìn)消化等藥理作用[5-6]。紅棗不僅含有豐富的營養(yǎng)成分，還富含多種生理活性物質(zhì)，如紅棗多糖、有機(jī)酸及黃酮類等物質(zhì)，具有抗疲勞、安神益氣、抗氧化多種保健功能[7]。

本研究以益生菌與傳統(tǒng)乳酸菌合理配比復(fù)合發(fā)酵制備北芪菇紅棗酸奶，并研究了其體外抗氧化活性，為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與儀器

益生菌為雙歧桿菌(Bifidobacterium)；發(fā)酵菌種為德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillusbulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)。

培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基，MC培養(yǎng)基，結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）培養(yǎng)基。

原料：北芪菇，北芪菇，市售紅棗，純牛奶，蔗糖（市售）。

儀器：榨汁機(jī)（BL25B36），HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，消解爐（SPT20），自動定氮儀（SPD60），電熱鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9140MBE），電熱恒溫培養(yǎng)箱（HPX-9082MBE），高壓滅菌鍋（DY04-13-44-00），PH計(jì)（PHS-3C）。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

（1）紅棗汁的制備工藝。

選料→清洗→浸泡紅棗（60℃，3 h）→去核→煮制（料液比1∶3、70℃，20 min）→打漿→殺菌（121℃，20 min）→過濾→冷卻→備用

（2）北芪菇紅棗酸奶生產(chǎn)工藝流程。

純牛奶→紅棗汁、北芪菇粉→混合→過濾→標(biāo)準(zhǔn)化（加蔗糖）→均質(zhì)（20 MPa，5 min）→殺菌→冷卻→接種→罐裝→發(fā)酵→后熟(4℃)→成品

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

改變單一因素，固定其他條件，分別考察北芪菇添加量、北芪菇與紅棗汁比、蔗糖添加量、菌種復(fù)配比（益生菌：發(fā)酵菌種(德氏乳桿菌保加利亞∶嗜熱鏈球菌=1∶1）、接種量、發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵溫度，感官評分為評價(jià)指標(biāo)，利用單因素實(shí)驗(yàn)確定各因素的最適范圍。不同因子梯度條件如表1所示。

表1 單因素水平設(shè)計(jì)

1.2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用中心組合實(shí)驗(yàn)Box-Behnken設(shè)計(jì)方案，選取北芪菇與紅棗汁比、蔗糖添加量、接種量3個變量，以A，B，C來表示，并以+1，0，-1分別代表其變量的水平；按方程x=(X-X0)/△X對自變量進(jìn)行編碼，其中：x為變量的編碼值；X為變量的真實(shí)值；X0為實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn)變量的真實(shí)值；△X為變量的步長變化。感官評分Y表示響應(yīng)值，如表2所示。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平編碼 %

1.2.4 檢驗(yàn)方法

（1）感官評價(jià)。感官評價(jià)小組共10人，年齡在18-25歲之間，均接受過《食品感官分析》課程培訓(xùn)。根據(jù)表3感官評分標(biāo)準(zhǔn)對益生菌復(fù)合發(fā)酵北芪菇紅棗酸奶進(jìn)行感官評價(jià)。

（2）抗氧化活性的測定。將益生菌酸奶進(jìn)行不同質(zhì)量濃度梯度稀釋，采用DPPH法和ABTS+法，分別測定其抗氧化活性[8-10]。

（3）活菌數(shù)的測定。益生菌酸奶采用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，用各種選擇培養(yǎng)基平板傾注法，測定乳酸菌和雙歧桿菌的活菌總數(shù)[11]。參考GB 4789.35-2010乳酸菌菌落數(shù)的測定方法[12]。

（4）滴定酸度的測定。參考GB5413-34-2010所述方法對發(fā)酵乳滴定酸度進(jìn)行測定[13]。

（5）蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定采用凱式定氮法[14]。

表3 益生菌復(fù)合發(fā)酵北芪菇紅棗酸奶感官評分標(biāo)準(zhǔn)

1.3 數(shù)據(jù)分析

本研究所有的試驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用Origin和Design-Expert(version8.0.6)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，運(yùn)用最小差異顯著法（LSD）進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 北芪菇添加量對酸奶感官評分的影響

如圖1所示，隨北芪菇添加量逐漸增大感官評分呈先升后降的趨勢，酸奶組織狀態(tài)無差異，當(dāng)添加量為0.20 g時(shí)，酸奶北芪菇味適中且口感細(xì)膩，當(dāng)添加量為0.25 g時(shí)，北芪菇的味道過重，且口感較粗糙。故選擇北芪菇添加量為0.20 g。

圖1 北芪菇添加量對酸奶感官評分的影響

2.1.2 北芪菇與紅棗汁比對酸奶感官評分的影響

如圖2所示，感官評分隨著北芪菇與紅棗汁比的升高先升后降，對酸奶口感影響較大。在比例為1∶25～1∶75之間，紅棗和北芪菇復(fù)合味道較淡，黏稠性較好；當(dāng)比例為1∶100時(shí)，復(fù)合味道適中，酸奶風(fēng)味濃郁，黏稠性好，口感細(xì)膩，無乳清析出；1∶125時(shí)，紅棗的味道過重，完全掩蓋了北芪菇的味道，故選擇北芪菇與紅棗的配比為1∶100(質(zhì)量體積比)。

2.1.3 蔗糖添加量對酸奶感官評分的影響

圖2 北芪菇與紅棗的配比對酸奶感官評分的影響

如圖3所示，感官評分隨著蔗糖添加量的增加呈現(xiàn)先升高再下降的趨勢，影響顯著。當(dāng)添加量為3%時(shí)，酸奶口味略偏酸，但有淡淡的紅棗味，口感較細(xì)膩；4%時(shí)，酸甜適口，有濃郁的酸奶味，并呈現(xiàn)出獨(dú)特的北芪菇紅棗復(fù)合風(fēng)味，口感細(xì)膩，黏稠性好；當(dāng)蔗糖添加量為5%～7%時(shí)，口感略甜，隨糖量增加，逐漸掩蓋了紅棗的風(fēng)味[15]。故選擇蔗糖添加量為4%。

圖3 蔗糖添加量對酸奶感官評分的影響

2.1.4 菌種復(fù)配比對產(chǎn)品品質(zhì)的影響

如圖4所示，感官評分隨著益生菌與傳統(tǒng)發(fā)酵菌種的比例變化呈現(xiàn)先升后降的趨勢，比例為1∶3時(shí)，酸奶口感細(xì)膩，酸甜適口，黏稠性好；比例繼續(xù)增大，酸味提高，對產(chǎn)品風(fēng)味有較大影響，故先擇菌種復(fù)配比1∶3。

圖4 菌種復(fù)配比對酸奶感官評分的影響

2.1.5 接種量對酸奶感官評分的影響

如圖5所示，隨著復(fù)合菌種（益生菌：發(fā)酵菌種=1:3）接種量的增大，感官評分呈先上升后下降的趨勢，影響顯著。當(dāng)接種量為0.02%～0.06%時(shí)，酸奶較為稀薄，口感略甜，可能是接種量少，發(fā)酵產(chǎn)酸不夠所致；當(dāng)接種量為0.10%時(shí)，有濃厚的酸奶風(fēng)味，口感細(xì)膩柔和，黏稠性好，無乳清析出；當(dāng)接種量為0.14%～0.18%時(shí)，有乳清析出，口感偏酸，黏稠度高。故選擇接種量為0.10%。

2.1.6 發(fā)酵時(shí)間對酸奶感官評分的影響

圖5 接種量對酸奶感官評分的影響

如圖6所示，感官評分隨著發(fā)酵時(shí)間的延長先上升再下降，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為5 h時(shí)，酸奶酸甜適口，黏稠性好，口感細(xì)膩，柔和，感官評分達(dá)90分；故選擇發(fā)酵時(shí)間為5 h。

圖6 發(fā)酵時(shí)間對酸奶感官評分的影響

2.1.7 發(fā)酵溫度對酸奶感官評分的影響

如圖7所示，隨著發(fā)酵溫度的升高感官評分呈先長后降的趨勢，當(dāng)發(fā)酵溫度為42℃時(shí)，酸奶酸甜可口，口感細(xì)膩，黏稠性好；溫度過低會造成乳酸菌發(fā)酵不夠，酸奶過甜，稀??；溫度過高則導(dǎo)致酸奶有少量的乳清析出，風(fēng)味有些偏酸[16-17]。故選擇發(fā)酵溫度為42℃。

圖7 發(fā)酵溫度對酸奶感官評分的影響

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（1）響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表4所示。

（2）模型的建立及其顯著性檢驗(yàn)。利用Design-Expert(version8.0.6)軟件對表3中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過多元回歸擬合，得到益生菌復(fù)合發(fā)酵北芪菇紅棗酸奶的感官評分（Y）對自變量北芪菇與紅棗的配比（A）、蔗糖添加量（B）、接種量（C）的回歸方程為

Y=89.40-3.37A+3.75B-0.88C-1.00AB-4.25AC-2.00BC-11.58A2-6.83B2-4.57C2。

由表4可知，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷腜＜0.0001，說明此模型極顯著，模型失擬項(xiàng)表示模型預(yù)測值與實(shí)際值不擬合的概率，此模型失擬項(xiàng)P=0.5413＞0.05，表明模型不顯著，擬合的概率高，運(yùn)用到試驗(yàn)中誤差小。該模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9888，且模型的調(diào)整確定系數(shù)R2Adj=0.9964，說明此模型能用于99.64%的實(shí)驗(yàn)結(jié)果解釋，僅只有0.36%的試驗(yàn)結(jié)果不能用此模型解釋，進(jìn)一步說明了回歸方程的擬合程度較好。

表4 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表5 回歸模型方差分析

由表5中的F值的大小可以判斷各因素對益生菌復(fù)合菌發(fā)酵北芪菇紅棗酸奶質(zhì)量影響的強(qiáng)弱，F(xiàn)值越大，說明該因素對于感官評價(jià)的影響程度越大。故根據(jù)上表可得出各因素對于北芪菇紅棗酸奶感官評價(jià)的影響程度大小依次為蔗糖添加量（B）＞北芪菇與紅棗汁比（A）＞接種量（C）。

根據(jù)上述回歸方程繪制出響應(yīng)面圖，以確認(rèn)北芪菇與紅棗汁比、蔗糖添加量、接種量3個因素對益生菌酸奶質(zhì)量的影響，如圖8所示。

由圖8可以看出，響應(yīng)值隨著北芪菇與紅棗的配比、蔗糖添加量與接種量的增加均呈現(xiàn)先增大后減小的變化趨勢，3個影響因素均存在一定的交互作用。從方差分析中可知，交互作用均極顯著。各圖中兩個因素曲面坡度相似，說明在固定實(shí)驗(yàn)水平范圍之內(nèi)，兩個因素對感官評分的變化影響相近。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過Design-Expert 8.0.6軟件分析得，最佳的制備工藝條件為北芪菇與紅棗汁比為1∶86（g/mL），蔗糖添加量為4.30%，接種量為0.10%，在此條件下的感官評價(jià)得分為90.2407分?？紤]實(shí)際操作的方便性，將最適參數(shù)修正為：北芪菇與紅棗的配比為1∶100（質(zhì)量體積比），蔗糖添加量為4%，接種量為0.10%，為了驗(yàn)證模型預(yù)測的準(zhǔn)確性，重復(fù)試驗(yàn)3次，所得平均值與理論預(yù)測值非常接近，且相對誤差小于2%，說明重復(fù)性良好。

2.4 抗氧化活性的測定

以維生素C作為對照，分別測定益生菌酸奶對DPPH、ABTS+自由基的清除效果，二者都表現(xiàn)出有很好的清除能力，而且與酸奶濃度成正比。這可能是由于添加北芪菇、紅棗后，酸奶中增加了多糖、酚類、蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)，進(jìn)而提高了樣品的抗氧化能力[18]。其中，對比兩種自由基清除能力發(fā)現(xiàn)，清除DPPH自由基的能力較ABTS+自由基高。

圖8 各因素交叉作用對益生菌酸奶的感官評分影響的響應(yīng)面和等高線

2.5 儲藏期內(nèi)益生菌酸奶活菌數(shù)的變化

由圖9可知，益生菌酸奶中活菌總數(shù)隨著儲藏時(shí)間的延長，在10～16 d期間菌數(shù)增長量大、增速快；隨著儲藏時(shí)間延長菌數(shù)逐漸下降，這可能是由于活菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物增多，造成的酸性環(huán)境對其菌體本身產(chǎn)生抑制，同時(shí)導(dǎo)致菌體進(jìn)入老化、衰亡期[19]。

圖9 儲藏間內(nèi)發(fā)酵乳活菌數(shù)的變化

2.6 產(chǎn)品質(zhì)量評價(jià)

（1）感官指標(biāo)。色澤：色澤均勻一致，乳黃色。組織狀態(tài)：細(xì)膩、均勻，允許有少量乳清析出。滋味：酸甜適口，口感絲滑，酸奶香氣濃郁，有爽口的紅棗味和淡淡的北芪菇味，無異味。

（2）理化指標(biāo)。蛋白質(zhì)為4.3%，酸度為74.2°T，p H值為4.5。均符合發(fā)酵乳GB19302-2010相關(guān)規(guī)定。

（3）微生物指標(biāo)。乳酸菌總數(shù)為4.4×107mL-1；菌落總數(shù)＜100 mL-1；大腸菌群數(shù)、致病菌未檢出。

3 結(jié) 論

試驗(yàn)對北芪菇紅棗酸奶的口感、酸度、活菌數(shù)進(jìn)行了測評，通過單因素與響應(yīng)面設(shè)計(jì)與分析，探索了益生菌雙歧桿菌與傳統(tǒng)乳酸菌(德氏乳桿菌保加利亞亞和嗜熱鏈球菌)復(fù)合發(fā)酵北芪菇紅棗酸奶的工藝條件。最佳條件為：北芪菇添加量為0.2 g，北芪菇與紅棗汁的配比為1∶100(質(zhì)量體積比)，益生菌與發(fā)酵菌比例1∶3，接種量0.1%，蔗糖添加量為4%，發(fā)酵溫度為42℃，發(fā)酵時(shí)間為5 h。按此配方研制的益生菌酸奶蛋白質(zhì)含量為4.38 g/100 g，酸度為74.2°T，乳酸菌總數(shù)為4.4×107mL-1，p H值為 4.5，口感細(xì)膩，色澤均勻。在儲藏期內(nèi)活菌數(shù)表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，優(yōu)于傳統(tǒng)乳酸菌菌種發(fā)酵的同類產(chǎn)品。經(jīng)添加北芪菇、紅棗汁制備的新型復(fù)合酸奶對DPPH和ABTS+均有較強(qiáng)的抗氧化性，且對DPPH自由基的清除能力更強(qiáng)，是一款風(fēng)味獨(dú)特、營養(yǎng)保健型的復(fù)合酸奶。