赪桐根4個(gè)極性部位抗炎活性的比較

唐云麗， 劉君君， 潘翠柳， 秦祖杰， 丘 琴， 歐和生

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西壯瑤藥工程技術(shù)研究中心，廣西南寧530020）

赪桐根為馬鞭草科大青屬植物赪桐Clerodendrum japonicum（Thunb.）Sweet的根，又名紅苓蔃、荷苞花、百日紅［1］、 棵朋必勞［2］、 “個(gè)朋被”［3］（廣西壯族語(yǔ)）， 為廣西常用壯藥［4-5］，其味甘，性涼，具清肺熱、利小便、涼血止血功效，主治肺熱咳嗽、熱淋小便不利、咳血、風(fēng)濕骨痛［6］等。

炎癥是多種疾病的共同過(guò)程，其發(fā)生發(fā)展與骨質(zhì)疏松［7］、 糖 尿 ?。?］、 心 血 管 系 統(tǒng) 疾 ?。?］、 阿 爾 茨 海 默?。?0-11］、 癲癇［12］、 癌癥密切相關(guān)［13-14］， 而一些具有良好抗炎作用的中草藥 （民族藥）可能通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)因子來(lái)對(duì)這些疾病產(chǎn)生較好的預(yù)防和治療作用。赪桐根為廣西常用民族藥，以其為君藥組成的赪銀合劑對(duì)風(fēng)熱型急性扁桃體炎有較好療效［15］，課題組前期研究證明，其水提物對(duì)急、慢性炎癥均具有明顯作用［16］，并且其醇提物也具有相應(yīng)活性，但具體部位及機(jī)制目前尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)比較赪桐根石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇部位抗炎活性，以期篩選出有效部位，進(jìn)一步明確活性成分，闡明其可能作用機(jī)制，為該藥材深度開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材 赪桐根采自武鳴區(qū)高峰林場(chǎng)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)滕建北副教授鑒定為馬鞭草科大青屬植物赪桐Clerodendrum japonicum （Thunb.） Sweet的根。

1.2 試藥 醋酸地塞米松 （浙江仙琚制藥股份有限公司，批號(hào)150116，0.75 mg）；頭孢克肟分散片 （浙江莎普愛(ài)思藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)160151E，50 mg）。二甲苯 （批號(hào) F20110613，500 mL）、冰醋酸 （批號(hào) T20110913，500 mL）、伊文思藍(lán) （批號(hào)Lot.No.20140723，10 g） （國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；角叉菜膠 （上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)YY13755，100 g）；水合氯醛 （成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)2016020101，250 g）。

1.3 儀器 SQP電子天平 ［賽多利斯科學(xué)儀器 （北京）有限公司］；UV-1780紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) ［島津儀器（蘇州）有限公司］；TGL-16G離心機(jī) （上海安亭科學(xué)儀器廠）；YXQ-LS-50S11立式壓力蒸汽滅菌器 （上海迅博實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；BP211D光柵型多功能酶標(biāo)儀 （瑞士Tecan公司）；LRH-250-S恒溫恒濕培養(yǎng)箱 （韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司）。

1.4 動(dòng)物 清潔級(jí)昆明種小鼠，雄性，體質(zhì)量18～22 g；清潔級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量180～220 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（桂）2014-0002，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。

2 方法

2.1 極性部位制備 取赪桐根粗粉3 kg，加75%乙醇回流提取3次，分別提取2、1.5、1 h，溶劑用量分別為10、8、6倍，過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮后置水浴鍋上揮干溶劑，稱定質(zhì)量，計(jì)算得膏率?？偨嘤?5%乙醇溶解后，硅膠按1∶1比例拌樣，置于回流裝置中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇回流提取，回收溶劑，減壓濃縮后分別得到石油醚部位19.6 g、乙酸乙酯部位31.7 g、正丁醇部位115.5 g、95%乙醇部位391.5 g，各部位浸膏用0.2%吐溫80溶解，分別配制成高、中、低質(zhì)量濃度溶液。

2.2 活性部位篩選及抗炎作用研究

2.2.1 對(duì)角叉菜膠致小鼠足跖腫脹的影響［16-17］取小鼠196只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組 （地塞米松0.005 g／kg）及赪桐根各極性部位高、中、低劑量組（40、20、10 g／kg）， 每組 14只。 灌胃給藥， 給藥量 20 mL／kg，1次／d，連續(xù)7 d，模型組灌胃等體積蒸餾水。末次給藥1 h后，于右后足趾部皮下注射1%角叉菜膠溶液0.02 mL致炎，15 min后脫頸椎處死，剪取后雙足等同部位，稱定質(zhì)量，以同一小鼠左右后足質(zhì)量之差為腫脹度，計(jì)算腫脹抑制率［18］。

2.2.2 對(duì)冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增加的影響［16，19］小鼠按 “2.2.1” 項(xiàng)下方法分組給藥， 末次給藥1 h后，小鼠尾靜脈注射0.3%伊文思藍(lán)溶液 （10 mL／kg），同時(shí)腹腔注射0.6%冰醋酸溶液 （10 mL／kg），15 min后脫頸椎處死，腹腔注射6 mL生理鹽水沖洗腹腔，剪開(kāi)腹腔收集腹腔液，3 000 r／min離心10 min，取上清液，于590 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

2.2.3 對(duì)小鼠棉球肉芽腫的影響 取小鼠196只，腹腔注射5%水合氯醛 （10 mL／kg）麻醉，無(wú)菌條件下在兩前肢中間的胸部用彎剪剪毛，75%酒精消毒皮膚，手術(shù)剪剪出皮下一小口，用鑷子從胸口皮下將棉球 （每粒10 mg，高壓滅菌）分別植入小鼠兩側(cè)腋下，縫合傷口并用碘伏消毒。術(shù)后第2天，小鼠按 “2.2.1”項(xiàng)下方法分組給藥，末次給藥1 h后脫頸椎處死，剪開(kāi)皮毛，取出棉球及周圍結(jié)締組織，剔去脂肪組織，稱定質(zhì)量，減去原棉球質(zhì)量后即為肉芽腫濕重，60℃下烘干至恒重，減去原棉球質(zhì)量后即為肉芽腫干重。

2.3 石油醚部位抗炎作用研究

2.3.1 二甲苯致摘除雙側(cè)腎上腺小鼠耳腫脹［20］取小鼠100只，術(shù)前1 d以頭孢克肟灌胃給藥，腹腔注射5%水合氯醛 （10 mL／kg）麻醉，在胸腰椎交界處沿背部正中線、背肋后緣作約0.5 cm長(zhǎng)的皮膚、肌肉切口，輕輕摘除腺體和另一側(cè)腎上腺，棉球稍止血后縫合肌肉和皮膚，涂以碘伏，術(shù)后第2天以頭孢克肟灌胃給藥，再連續(xù)3 d給予5%葡萄糖生理鹽水溶液代替蒸餾水飼養(yǎng)。然后，小鼠隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性組及石油醚部位高、中、低劑量組，按“2.2.1”項(xiàng)下方法分組給藥，末次給藥1 h后，于右耳正反兩面各涂二甲苯10 μL致炎，15 min后處死，沿耳根部剪下兩耳，6 mm打孔器在兩耳相同部位等面積打下圓耳片，稱定質(zhì)量，計(jì)算腫脹度和腫脹抑制率，公式分別為腫脹度＝右耳質(zhì)量－左耳質(zhì)量、腫脹抑制率＝［（模型組腫脹度－給藥組腫脹度）／模型組腫脹度］×100%。

2.3.2 角叉菜膠致摘除雙側(cè)腎上腺小鼠足跖腫脹［21-22］取小鼠60只，按 “2.3.1”項(xiàng)下方法摘除雙側(cè)腎上腺，按“2.2.1”項(xiàng)下方法分組給藥，隨后剪碎右足，4 mL生理鹽水浸泡［13］， 勻漿后 3 000 r／min離心 10 min， 上清液于－20℃下保存，參照試劑盒操作步驟，采用ELISA法測(cè)定SOD活性和MDA、NO水平。

2.3.3 對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的影響［23］大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、地塞米松組 （0.00 5 g／kg）及石油醚部位高、中、低劑量組，按 “2.2.1”項(xiàng)下方法給藥，每天1次，連續(xù)7 d，空白組、模型組給予等體積蒸餾水。末次給藥1 h后，于大鼠右足皮下注射0.1 ml弗氏完全佐劑，6 h后麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，37℃下水浴1 h后，4℃、3 000 r／min離心20 min，取血清分裝，－20℃下保存，參照試劑盒操作步驟，采用ELISA法測(cè)定TNF-α、PGE2、IL-1β、 IL-6、 LTB4水平。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 19.0軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)均以 （±s）表示，均值比較采用單因素方差分析，假定方差齊性采用LSD法，未假定方差齊性采用Dunnett’s T3法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 赪桐根活性部位篩選及抗炎作用研究

3.1.1 對(duì)角叉菜膠致小鼠足跖腫脹的影響 圖1顯示，與模型組比較，除乙酸乙酯部位低劑量組外，各極性部位組對(duì)角叉菜膠致小鼠足跖腫脹均有顯著抑制作用 （P＜0.05，P＜0.01）。

圖1 對(duì)角叉菜膠致小鼠足跖腫脹的影響（±s， n＝12～14）

3.1.2 對(duì)冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增加的影響圖2顯示，與模型組比較，除石油醚部位低劑量組外，各極性部位組均能顯著抑制冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增加 （P＜0.01）。

圖2 對(duì)冰醋酸致小鼠毛細(xì)血管通透性增加的影響 （±s，n＝12～14）

3.1.3 對(duì)小鼠棉球肉芽腫的影響 圖3顯示，與模型組比較，各極性部位組對(duì)小鼠棉球肉芽腫均有顯著抑制作用（P＜0.05， P＜0.01）。

3.2 石油醚部位抗炎作用

3.2.1 對(duì)摘除雙側(cè)腎上腺小鼠的影響

3.2.1.1 二甲苯致耳腫脹 圖4顯示，與模型組比較，石油醚部位組顯著抑制二甲苯致耳腫脹 （P＜0.05，P＜0.01）。

3.2.1.2 對(duì)角叉菜膠致足跖腫脹的影響 圖5顯示，與模型組比較，石油醚部位高劑量組顯著抑制角叉菜膠致足腫脹 （P＜0.01）。

3.2.2 對(duì)MDA、NO水平和SOD活性的影響 圖6～8顯示，與模型組比較，石油醚部位組顯著降低MDA、NO水平 （P＜0.05， P＜0.01）， 升高 SOD 活性 （P＜0.01）。

圖3 對(duì)小鼠棉球肉芽腫的影響 （±s， n＝12～14）

圖4 對(duì)二甲苯致耳腫脹小鼠的影響 （±s， n＝10～13）

圖5 對(duì)角叉菜膠致足跖腫脹小鼠的影響（±s， n＝10～13）

3.2.3 對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的影響 圖9～13顯示，與模型組比較，石油醚部位組顯著降低TNF-α、PGE2、IL-1β、IL-6、 LTB4水平 （P＜0.05， P＜0.01）。

4 討論

赪桐根為廣西常用壯藥，具有清肺熱、涼血止血功效，主治肺熱咳嗽、咳血、風(fēng)濕骨痛等［6］，主要含有鞣質(zhì)、有機(jī)酸、皂苷、黃酮類、酚類、植物甾醇、三萜類、揮發(fā)油等成分［24］， 其中鞣質(zhì)［25］、 植物甾醇［26］、 黃酮類［27］、 皂苷［28-29］等具有良好的抗炎作用。臨床研究證實(shí)，赪銀合劑對(duì)風(fēng)熱型急性扁桃體炎有較好療效［15］，赪桐根是其主要君藥；陳俊等［16］發(fā)現(xiàn)，赪桐根水提物對(duì)急、慢性炎癥均具有明顯作用。

圖6 對(duì)MDA水平的影響 （±s， n＝8～10）

圖7 對(duì)SOD活性的影響 （±s， n＝8～10）

圖8 對(duì)NO水平的影響 （±s， n＝8～10）

圖9 對(duì)TNF-α水平的影響 （±s， n＝8～10）

圖10 對(duì)PGE2水平的影響 （±s， n＝8～10）

圖11 對(duì)IL-1β水平的影響 （±s， n＝8～10）

炎癥反應(yīng)是許多不同類型疾病 （如生物性、化學(xué)性及物理性疾?。┑墓餐±磉^(guò)程，也是機(jī)體最基本的抗損傷反應(yīng)，以紅、腫、熱、痛為主要臨床特征，是致炎因子刺激具有血管系統(tǒng)的活體組織對(duì)局部損傷的反應(yīng)，可分為早、中、晚三期，其中在急性炎癥或炎癥早期，以血管壁通透性增強(qiáng)、白細(xì)胞和蛋白質(zhì)造成組織腫脹為特征；在慢性炎癥或炎癥后期，以纖維組織增生、肉芽腫形成為特點(diǎn)［20］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，赪桐根石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇部位均具有非常明顯的抗炎效果，以石油醚部位最強(qiáng)，乙酸乙酯部位次之；通過(guò)冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增加、角叉菜膠致小鼠足跖腫脹實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，4個(gè)部位具有很強(qiáng)的抑制小鼠足腫脹、明顯改善炎癥早期的通透性增加作用；通過(guò)小鼠棉球肉芽腫實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，它們對(duì)炎癥后期也具有顯著的抑制作用，可改善腫脹；通過(guò)去腎上腺小鼠模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，石油醚高劑量組有抗炎活性，但有所減弱，推測(cè)可能不完全依賴于下丘腦-垂體-腎上腺軸 （HPAA）系統(tǒng)，而是部分依賴機(jī)體內(nèi)源性抗炎系統(tǒng)；通過(guò)檢測(cè)去腎上腺小鼠足腫脹部位炎癥因子水平發(fā)現(xiàn)，去腎上腺后赪桐根石油醚部位可提高小鼠SOD活性，降低MDA、NO水平，從而發(fā)揮抗炎作用。

圖12 對(duì)IL-6水平的影響 （±s， n＝8～10）

圖13 對(duì)LTB4水平的影響 （±s， n＝8～10）

超氧化物歧化酶 （SOD）是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，具有特殊生理活性，也是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)；丙二醛 （MDA）是自由基引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的一種產(chǎn)物，可激活環(huán)氧化酶 （COX），一方面促進(jìn)花生四烯酸產(chǎn)生前列腺素 （PG），導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂形成炎癥，而另一方面可影響白三烯代謝形成炎癥［16，24，30-31］； 一氧化氮（NO）是一種重要的炎癥介質(zhì)，能誘導(dǎo)促炎癥因子產(chǎn)生，如腫瘤壞死因子-α （TNF-α）、 白介素-1β （IL-1β） 等。TNF-α、IL-1β、IL-6等均為重要炎癥介質(zhì)，是多種信號(hào)通路的關(guān)鍵因素，其中TNF-α是一種單核因子，主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌，作為主要的促炎細(xì)胞因子，它可與多種類型組織因子和基質(zhì)蛋白相互作用，使RA關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)刺激滑膜細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子、蛋白激酶、前列腺素E（PGE），直接損害組織；IL-1β是對(duì)骨吸收和軟骨破壞的關(guān)鍵因子；IL-6是由T細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、滑液成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的多效炎性細(xì)胞因子，參與多種生物過(guò)程，如T細(xì)胞活化、急性期應(yīng)答誘導(dǎo)、滑液成纖維細(xì)胞增殖［32］。另外，前列腺素E2（PGE2）、白三烯B4（LTB4）為花生四烯酸代謝途徑產(chǎn)生的2個(gè)重要炎癥遞質(zhì)，前者可增加血管通透性，而后者可引起白細(xì)胞趨化、聚集、脫顆粒，產(chǎn)生超氧陰離子，從而加重炎癥反應(yīng)。

綜上所述，赪桐根石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇部位具有良好的抗炎作用，以石油醚部位最強(qiáng)，并依賴于HPAA軸內(nèi)部抗炎系統(tǒng)，其抗炎機(jī)制可能與減少M(fèi)DA、 NO、 TNF-α、 PGE2、 IL-1β、 IL-6、 LTB4 等炎癥因子生品、提高SOD活性有關(guān)，具體活性成分及其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。