七味蟾參方水提工藝的優(yōu)化

邢增智， 張愛(ài)軍， 陳園園， 李 帥， 曾 宇

（1.廣東藥科大學(xué)，廣東廣州510006；2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川成都610041）

七味蟾參方來(lái)源于四川省中醫(yī)藥科學(xué)院附屬四川省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由干蟾皮、壁虎、喜樹果等藥材而成，臨床上用于進(jìn)展期胃癌化療后的協(xié)同治療，具有減毒增效、提高患者免疫力的作用，療效顯著。該方通常以水煎湯劑的形式應(yīng)用于臨床，但服用前需先進(jìn)行煎煮，造成一定不便，為了提高患者用藥依從性，同時(shí)使其便于保存和攜帶，擬將全方水提取后開發(fā)成固體制劑。

本實(shí)驗(yàn)選擇七味蟾參方中的藥效成分華蟾酥毒基、喜樹堿、總多糖提取率及干膏得率的綜合評(píng)分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法結(jié)合信息熵理論優(yōu)化該方水提工藝，以期為其工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀，配置四元泵、DAD檢測(cè)器 （美國(guó)Agilent公司）；UV-2401PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) （日本島津公司）；JY5002電子天平 （上海良平儀器儀表有限公司）；XS205電子天平 （瑞士Mettler-Toledo公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 （上海亞榮生化儀器廠）；ST16R高速冷凍離心機(jī) （美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）。

1.2 試藥 干蟾皮、壁虎購(gòu)自山東康源堂中藥飲片股份有限公司，喜樹果購(gòu)自四川利民中藥飲片有限責(zé)任公司，其余藥材飲片均購(gòu)自四川省中藥飲片有限責(zé)任公司，按2015版 《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)鑒定均為正品。D-無(wú)水葡萄糖 （批號(hào)110833-201205）、喜樹堿 （批號(hào) 100532-200401）、華蟾酥毒基 （批號(hào)110803-200605）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 華蟾酥毒基、喜樹堿含有量測(cè)定［1-4］

2.1.1 色譜條件

2.1.1.1 華蟾酥毒基 Phenomenex C18色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-0.5%磷酸二氫鉀（45∶55）；檢測(cè)波長(zhǎng)296 nm；體積流量1.0 mL／min；柱溫30℃； 進(jìn)樣量20 μL。

2.1.1.2 喜樹堿 Phenomenex C18色譜柱 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流動(dòng)相水-甲醇， 梯度洗脫 （0～25 min，30% ～40%甲醇； 25～40 min， 40% ～50%甲醇； 40～60 min，50%～70%甲醇，再運(yùn)行5 min）；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；體積流量1.0 mL／min；柱溫30℃； 進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取華蟾酥毒基、喜樹堿對(duì)照品適量，甲醇制成每1 mL分別含10.28、13.34 μg上述成分的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 按處方比例稱取藥材，按設(shè)計(jì)方案進(jìn)行提取，加熱濃縮，60℃減壓干燥得干膏，取0.5 g左右，加入50 mL甲醇超聲40 min，過(guò)濾，濾液減壓濃縮，甲醇定容至10 mL，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得華蟾酥毒基供試品溶液。再取上述干膏適量，加入30 mL 75%乙醇超聲30 min，過(guò)濾，濾液水浴蒸干，75%乙醇定容至5 mL，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得喜樹堿供試品溶液。

2.1.4 陰性樣品溶液制備 按處方比例稱取不含干蟾皮、喜樹果的藥材飲片，按 “2.1.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.1.5 方法學(xué)考察 以峰面積為縱坐標(biāo) （Y），相應(yīng)對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) （X）進(jìn)行回歸，得華蟾酥毒基、喜樹堿方程分別為Y＝859.38X－0.367 2 （r＝0.999 7）、 Y＝4 262.2X－1.082 （r＝0.999 8）， 分別在 1.028～20.56、1.334～26.668 μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。對(duì)照品溶液中華蟾酥毒基、喜樹堿峰面積RSD（n＝6）分別為0.38%、0.87%，表明儀器精密度良好。2種色譜條件下同一供試品溶液于0、2、4、6、8、12 h峰面積 RSD分別為1.93%、1.63%，表明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。供試品中華蟾酥毒基、喜樹堿含有量RSD（n＝6）分別為1.57%、1.70%，表明該方法重復(fù)性良好。華酥蟾毒基、喜樹堿平均加樣回收率分別為 98.55%、101.29%，RSD分別為 1.42%、2.39%。色譜圖見(jiàn)圖1～2。

圖1 華蟾酥毒基HPLC色譜圖

圖2 喜樹堿HPLC色譜圖

2.2 總多糖含有量測(cè)定［5-6］

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品適量，加水制成每1 mL含0.101 4 mg該成分的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取各工藝所得浸膏約0.8 g，精密加50 mL水超聲40 min溶解，精密吸取上清液1 mL， 9 mL無(wú)水乙醇醇沉12 h， 5 000 r／min離心 15 min，棄去上清液，3 mL水溶解沉淀，即得。

2.2.3 蒽酮-硫酸溶液制備 稱取蒽酮0.1 g，加入100 mL濃硫酸，搖勻至蒽酮全部溶解，即得。

2.2.4 方法學(xué)考察 以吸光度為縱坐標(biāo) （A），葡萄糖溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) （X）進(jìn)行回歸，得到方程為A＝0.014 2X＋0.073 1 （r＝ 0.999 7）， 在 10.33～61.98 μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。對(duì)照品溶液吸光度RSD（n＝6）為1.80%，表明儀器精密度良好。同一供試品溶液于0、1、2、3、4、5、6、7 h吸光度RSD為2.05%，表明溶液在7 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。供試品溶液吸光度RSD（n＝6）為2.57%，表明該方法重復(fù)性良好。葡萄糖的平均加樣回收率為100.92%，RSD為2.44%。

2.3 水提工藝優(yōu)化

2.3.1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法［6-7］由于提取次數(shù)為非連續(xù)變量，進(jìn)行回歸處理比較困難。前期已對(duì)加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行考察，隨后又針對(duì)提取次數(shù)以正交試驗(yàn)最優(yōu)提取工藝為基礎(chǔ)進(jìn)行單因素考察，最終確定為3次。因素水平見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 因素水平

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3.2 信息熵理論［8-9］建立原始評(píng)價(jià)指標(biāo)指標(biāo)矩陣（X），再將原始矩陣轉(zhuǎn)換為概率矩陣 （P），結(jié)果如下。

然后，計(jì)算各項(xiàng)指標(biāo)的信息熵 （Hi），得到評(píng)價(jià)指標(biāo)Hi＝［0.992 6 0.985 9 0.994 8 0.999 4］，再計(jì)算第i項(xiàng)指標(biāo)的系數(shù)Wi＝ ［0.271 1 0.516 5 0.190 5 0.022 0］， 測(cè)得華蟾酥毒基、喜樹堿、總多糖、干膏得率的權(quán)重系數(shù)分別為0.271 1、0.516 5、0.190 5、0.022 0。再將概率矩陣的全部數(shù)據(jù)加權(quán)處理， 得到綜合評(píng)分 Y＝ （Xi華蟾酥毒基／Xmax華蟾酥毒基× 0.271 1 ＋ Xi喜樹堿／Xmax喜樹堿× 0.516 5 ＋ Xi總多糖／Xmax總多糖×0.190 5＋Xi干膏得率／Xmax干膏得率×0.022 0） ×100， 結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.3 方程擬合與方差分析［6-7］將所得數(shù)據(jù)通過(guò)Designexpert 8.0.6軟件進(jìn)行處理，進(jìn)行多元線性、二次多項(xiàng)式回歸，分別得到方程Y＝8.521 83X1＋11.490 19X2＋8 296 154（r＝0.636 1， P＝0.030 1）、 Y＝96.760 00＋8.521 83X1＋11.490 19X2－0.537 50X1X2－11.195 00X12－11.227 50X22（r＝0.997 3，P＜0.000 1），以后者擬合效果更好，方差分析見(jiàn)表3。由表可知，模型F值為69.58，P＜0.000 1，具有顯著意義，而失擬項(xiàng)不顯著 （P＞0.05），表明方程在整個(gè)回歸區(qū)域內(nèi)擬合情況良好。

圖3 各因素響應(yīng)面圖

表3 方差分析

2.3.4 響應(yīng)面圖［6-7］見(jiàn)圖3。結(jié)合實(shí)際情況和成本，確定最優(yōu)工藝為加10倍量水提取3次，每次70 min，綜合評(píng)分96.94。

2.3.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 按 “2.3.4”項(xiàng)下優(yōu)化工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，平行 3次，測(cè)得綜合評(píng)分分別為 94.88、95.37、96.62，平均95.62（RSD＝0.94%），與預(yù)測(cè)值96.94相當(dāng)（偏差率為1.36%），表明模型預(yù)測(cè)性良好，工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

干蟾皮是蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍的干燥皮，功效清熱解毒、利水消腫，具有抗腫瘤作用，活性成分主要為蟾毒配基類和吲哚生物堿類，其中前者包擴(kuò)華蟾酥毒基等［10］；壁虎為壁虎科動(dòng)物無(wú)蹼壁虎或多疣壁虎的干燥全體，又稱為天龍、守宮等，其味咸寒，功效祛風(fēng)定驚、軟堅(jiān)散結(jié)、解毒，守宮多糖是其抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)的重要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)［11］；喜樹果為藍(lán)果樹科喜樹屬植物喜樹的干燥成熟果實(shí)，功效清熱解毒、散結(jié)消癥，用于治療食道癌、胃癌、腸癌、肝癌等，喜樹堿是其發(fā)揮抗腫瘤作用的主要活性成分［12］。七味蟾參方中干蟾皮和壁虎為君藥，喜樹果為臣藥，本實(shí)驗(yàn)基于中醫(yī)藥理論以及相關(guān)藥效學(xué)研究，最終確定三者所含成分作為指標(biāo)。另外，干膏得率也常作為中藥復(fù)方提取工藝的評(píng)價(jià)指標(biāo)，故也將其納入研究。

根據(jù)熱力學(xué)中熵的概念，將信號(hào)集的平均信息量稱為信息熵，將相關(guān)理論應(yīng)用于中藥提取工藝，即用熵值法計(jì)算出各指標(biāo)權(quán)重，再將復(fù)方中多項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)綜合成為單一度量指標(biāo)，從而對(duì)其進(jìn)行客觀評(píng)價(jià)［13］。本實(shí)驗(yàn)將信息熵理論與星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法相結(jié)合，可避免以往由實(shí)驗(yàn)人員主觀賦予指標(biāo)成分權(quán)重的做法，使得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)綜合評(píng)價(jià)結(jié)果更可靠，提升了研究嚴(yán)謹(jǐn)性。

星點(diǎn)設(shè)計(jì)又稱中心組合設(shè)計(jì)，為一種多因素五水平的試驗(yàn)，是在二水平析因設(shè)計(jì)基礎(chǔ)上加上極值點(diǎn)和中心點(diǎn)構(gòu)成的；響應(yīng)面法是通過(guò)描繪響應(yīng)值對(duì)考察因素的響應(yīng)面，從中選取較佳效應(yīng)區(qū)，從而回推出自變量取值范圍，即最佳條件的優(yōu)化方法，星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法近年來(lái)常用于優(yōu)化藥材和制劑提取工藝、篩選處方，與均勻設(shè)計(jì)、正交設(shè)計(jì)相比具有精密度高、試驗(yàn)次數(shù)少、可同時(shí)考察各因素交互作用等優(yōu)勢(shì)，考察的水平數(shù)大多為2、3、4因素［14］。本實(shí)驗(yàn)采用該方法優(yōu)化七味蟾參方水提工藝，確定最優(yōu)工藝為加10倍量水提取3次，每次70 min，驗(yàn)證試驗(yàn)表明該方法簡(jiǎn)單合理，穩(wěn)定可行，可為該方進(jìn)一步開發(fā)及工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。