通竅活血湯含藥腦脊液對谷氨酸致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

翟 燕， 汪 寧?， 章亞兵， 王 艷

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥230012；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥藥效與安全性評價(jià)研究所，安徽合肥230012）

腦卒中屬于中醫(yī) “中風(fēng)”范疇，其病機(jī)核心為氣血逆亂及血溢脈外，而病變關(guān)鍵則為 “血瘀”，“活血化瘀”治則是臨床上治療中風(fēng)的基本方法之一［1］。通竅活血湯為清代醫(yī)家王清任所創(chuàng)立的活血化瘀的經(jīng)典方，主要由麝香、桃仁、赤芍、川芎、紅花等中藥組成，可治頭面四肢周身血管血瘀之證，臨床上對中風(fēng) （包括腦梗死、血管性癡呆、腦供血不足等）、偏頭痛、腦外傷性耳鳴耳聾、眩暈等疾病防治及癥狀改善有確切療效［2-3］。課題組前期研究表明，含藥腦脊液對腦缺血缺氧的大鼠、小鼠有顯著保護(hù)作用［4-5］，其機(jī)制與保護(hù)腦組織抗氧化酶活性、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、減輕自由基對腦組織損傷、減輕腦水腫等有關(guān)［6］；作用于谷氨酸損傷的PC12細(xì)胞時(shí)，對其有顯著保護(hù)作用［7］。

由于血腦屏障的存在，腦脊液成分與血清成分無論在生理性或是藥物成分上都存在顯著差異，中藥及復(fù)方的神經(jīng)保護(hù)作用與其在體內(nèi)的移行成分能否通過血腦屏障有很大聯(lián)系。因此，以中藥復(fù)方灌胃給與大鼠后獲取的含藥腦脊液代替血清，通過體外實(shí)驗(yàn)研究中藥藥理作用，可避免血清中復(fù)雜成分干擾，體現(xiàn)復(fù)方中效應(yīng)成分的藥理作用［8］，本實(shí)驗(yàn)將從細(xì)胞水平探討含藥腦脊液對谷氨酸損傷的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。

1 材料

1.1 動物及細(xì)胞株 SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量（250±20）g，由安徽醫(yī)科大學(xué)提供，動物許可證號SCXK（皖）20140009。PC12細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所。

1.3 儀器 CO2培養(yǎng)箱 （日本SANYO公司）；潔凈工作臺 （蘇凈集團(tuán)安泰公司）；CK2型倒置顯微鏡 （日本Olympus公司）；ELX800MV型酶聯(lián)免疫檢測儀、ELX800uv酶標(biāo)儀 （美國Bio-Tek公司）；流式細(xì)胞儀 （美國Beckman公司）。

1.4 試藥 谷氨酸 （國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號 20140108）；0.25%胰蛋白酶 （美國Gibco公司， 批號 1546270）；NO （批號20140817）、 LDH （批號 20140923）、 MDA （批號20140818）、SOD （批號 20140822）、 ATP酶 （批號20140821）、Annexin V-FITC雙染細(xì)胞凋亡 （批號20140003）檢測試劑盒 （南京建成生物工程研究所）。

2 方法

2.1 PC12細(xì)胞培養(yǎng) 將神經(jīng)誘導(dǎo)因子分化過的PC12細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基RP-1640（含20%胎牛血清、100 U／mL青霉素、100 mg／L鏈霉素），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長，待細(xì)胞長至80%密度時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化傳代，約4 d傳代1次。

2.2 含藥腦脊液制備［6，9］首先制備 10倍量湯劑，方法為稱取桃仁90 g、赤芍30 g、川芎30 g、紅花90 g、老蔥30 g、大棗50 g于圓底燒瓶中，加入10倍量70%乙醇浸泡2 h，回流提取2 h，過濾，藥材殘?jiān)尤?倍量70%乙醇回流提取1.5 h，過濾，濾液濃縮至無醇味，加入1.5 g人工麝香，加水定容，制成生藥量2 g／mL的提取液，即得。再取大鼠 300只， 灌胃提取液 （0.5 g／mL）， 劑量0.3 mL／100 g，早晚各1次，連續(xù)5 d。末次給藥1.5 h后， 腹腔注射水合氯醛 （350 mg／kg） 麻醉，頸后部備皮，75%酒精消毒，頸部彎曲暴露枕骨，1 mL無菌注射器從枕骨大孔刺入延髓池，取出腦脊液，4℃離心 （3 000 r／min）10 min， 取上清，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，－20℃下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 模型建立［10］取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后接種于96孔板，密度為2×105／mL每孔100 μL，細(xì)胞貼壁 （約6 h）后換用無血清培養(yǎng)基饑餓12 h，加入 2.5、 5、 10、 15、 20、 25、 50 mmol／L 含谷氨酸空白培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)4 h后每孔加入5 mg／mL MTT染液20 μL， 繼續(xù)培養(yǎng)4 h， 吸去孔內(nèi)上清液并加入 150 μL DMSO，37℃性孵育10 min后置搖床上慢速振蕩10 min，待孔內(nèi)顆粒狀物完全溶解，于490 nm波長處測定吸光度。

2.4 空白腦脊液對PC12細(xì)胞活性的影響 各組加入0、2.5%、5%、10%、20%、40%空白腦脊液，MTT法測定吸光度，確定腦脊液含有量。

2.5 分組 空白組：RPM-1640培養(yǎng)基＋空白腦脊液 （5%、10%、20%），模型組：RPM-1640培養(yǎng)基＋谷氨酸＋空白腦脊液 （5%、10%、20%），通竅活血湯含藥腦脊液組：RPM-1640培養(yǎng)基＋谷氨酸＋通竅活血湯 （5%、10%、20%）。各組加入不同濃度空白腦脊液或含藥腦脊液，1 h后模型組、通竅活血湯含藥腦脊液組加入12.5 mmol／L谷氨酸進(jìn)行損傷，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

課程實(shí)驗(yàn)一般開學(xué)初制定好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃表，實(shí)驗(yàn)室是按計(jì)劃進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)的，平時(shí)不開放，按教學(xué)進(jìn)度集中在某段時(shí)間實(shí)驗(yàn)，排得比較滿，一個(gè)班接一個(gè)班。為了保證學(xué)生在有限的時(shí)間內(nèi)順利按時(shí)完成實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)問題，由老師直接檢查解決，實(shí)驗(yàn)老師人數(shù)多、老師能力強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)做得就有保障。對于問題產(chǎn)生的原因和解決的方法，有學(xué)生問，老師才盡力講解或先解決事后再解釋，否則有可能影響后面的學(xué)生做實(shí)驗(yàn)，這樣使得實(shí)驗(yàn)雖然做了，但達(dá)不到實(shí)驗(yàn)教學(xué)應(yīng)有的效果。

2.6 含藥腦脊液對PC12細(xì)胞形態(tài)的影響 各組培養(yǎng)、造模、給藥后，細(xì)胞置于相差倒置顯微鏡下觀察拍照。

2.7 含藥腦脊液對PC12細(xì)胞增殖活性的影響 各組培養(yǎng)、造模、給藥后，在490 nm波長下通過MTT法檢測。

2.8 含藥腦脊液對PC12細(xì)胞膜通透性的影響

2.8.1 臺盼藍(lán)染色 各組培養(yǎng)、造模、給藥后，消化收集細(xì)胞，將各組細(xì)胞密度調(diào)整至1×105／mL，各取50 μL， 加入 0.4%臺盼藍(lán)溶液 5 μL染色，2 min時(shí)用細(xì)胞計(jì)數(shù)板在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，死細(xì)胞因膜通透性增加被臺盼藍(lán)染色，活細(xì)胞細(xì)胞膜選擇性通過功能存在而不被染色，分別記錄染色、未染色細(xì)胞濃度，計(jì)算活細(xì)胞比率 （未染色細(xì)胞濃度／總細(xì)胞濃度×100%）。

2.8.2 LDH法 各組培養(yǎng)、造模、給藥后，吸取每孔內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照相應(yīng)試劑盒操作步驟檢測上清液中LDH活性。

2.9 含藥腦脊液對PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激與NO水平的影響

2.9.1 NO水平檢測 各組培養(yǎng)、造模、給藥后，吸取各孔細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照NO檢測試劑盒操作步驟檢測NO水平。

2.9.2 活性氧 （ROS）水平檢測 各組培養(yǎng)、造模、給藥后， 胰酶消化， 離心 （1 500 r／min）5 min后收集各組細(xì)胞。各組細(xì)胞分別懸浮于DCFH-DA終濃度為10 μmol／L的無血清培養(yǎng)基中，輕輕吹打混勻，孵育20 min，每隔3 min緩慢顛倒混勻，以使DCFH-DA和細(xì)胞充分接觸反應(yīng)，無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，洗凈未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA，酶標(biāo)儀于488 nm激發(fā)波長、525 nm發(fā)射波長處檢測熒光強(qiáng)度。

2.9.3 SOD活性、MDA水平檢測 各組培養(yǎng)、造模、給藥后，收集各孔細(xì)胞，超聲細(xì)胞破碎儀破碎，按相應(yīng)試劑盒操作步驟檢測。

2.10 含藥腦脊液對PC12細(xì)胞能量代謝的影響

2.10.1 ATP酶活性檢測 各組培養(yǎng)、造模、給藥后，收集每孔內(nèi)細(xì)胞，混懸于生理鹽水中，超聲細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，按ATP酶檢測試劑盒操作步驟檢測。

2.10.2 游離Ca2＋水平檢測 各組培養(yǎng)、造模、給藥后，離心 （1 500 r／min）5 min，收集各組細(xì)胞，加入 Fura-2／AM 濃度為 2 μmol／L 的 Hepes 溶液1 mL，輕輕吹打混勻，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)45 min，熒光染料充分反應(yīng)后再離心，去除上清液，Hepes輕輕吹打，洗凈游離染料，再加入Hepes培養(yǎng) 1 h，酶標(biāo)儀檢測，激發(fā)波長 340、380 nm，發(fā)射波長510 nm。細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞膜，振蕩混勻后同法測定熒光強(qiáng)度，此時(shí)為Ca2＋飽和時(shí)熒光強(qiáng)度，加入EGTA與細(xì)胞內(nèi)鈣充分反應(yīng)，振蕩混勻后測定熒光，此時(shí)為零Ca2＋時(shí)熒光強(qiáng)度，計(jì)算 Ca2＋水平， 公式為 ［Ca2＋］ ＝Kd（F0／Fs）（RRmin） ／（Rmax－R）， 其中 Kd為 Fura-2 與 Ca2＋反應(yīng)的解離常數(shù) （224 nmol／L）， F0、 Fs分別為 Ca2＋為0、飽和狀態(tài)下的熒光強(qiáng)度，R為所檢測熒光比值，Rmax、Rmin分別為最大、最小熒光比值。

2.11 含藥腦脊液對PC12細(xì)胞凋亡率的影響 細(xì)胞藥物作用后棄去培養(yǎng)液，冰冷PBS洗滌2次，用不含EDTA的胰酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)后取1×105，離心 （4℃、1 000 r／min） 10 min， 棄上清， 加入1 mL冰冷PBS洗滌細(xì)胞2次，輕輕振蕩使細(xì)胞懸浮， 離 心 （4 ℃、 1 000 r／min）。 細(xì) 胞 重 懸 于200 μL結(jié)合緩沖液中， 加入 5 μL Annexin V-FITC輕輕混勻，避光下室溫反應(yīng)15 min，加入200 μL結(jié)合緩沖液 （總反應(yīng)體積 400 μL） 及 5 μL PI，1 h內(nèi)上機(jī)檢測。

2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 19.0軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以 （±s）表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，2組間數(shù)據(jù)比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 谷氨酸對PC12細(xì)胞活性的影響 圖1顯示，谷氨酸對PC12細(xì)胞有顯著損傷作用，并呈劑量依賴性 （P＜0.05，P＜0.01），細(xì)胞存活率 （實(shí)驗(yàn)組OD值／陰性對照OD值×100%）接近50%時(shí)，本實(shí)驗(yàn)選擇其對應(yīng)的濃度 （20 mmol／L）作為造模濃度。

3.2 空白腦脊液對PC12細(xì)胞增殖的影響 圖2顯示，空白腦脊液濃度在0～20%范圍內(nèi)對PC12細(xì)胞生長有顯著促進(jìn)作用 （P＜0.05，P＜0.01），而在40%時(shí)有所下降，故本實(shí)驗(yàn)將其設(shè)定為5%、10%、20%。

3.3 含藥腦脊液對PC12細(xì)胞形態(tài)的影響 圖3顯示，與模型組比較，含藥腦脊液組細(xì)胞存活率顯著提高，活細(xì)胞數(shù)顯著增加，類似神經(jīng)突起的細(xì)胞軸突易見的細(xì)胞比例顯著更多，細(xì)胞間聯(lián)系較多，細(xì)胞漂浮顯著降低，具折光性細(xì)胞顯著增加，簇狀生長細(xì)胞較多，離散單一的細(xì)胞數(shù)量較少。

圖1 谷氨酸對PC12細(xì)胞活性的影響 （±s， n＝6）Fig.1 Effect of glutamic acid on PC12 cell viability（±s， n＝6）

圖2 空白腦脊液對PC12細(xì)胞增殖的影響 （±s， n＝6）Fig.2 Effect of blank cerebrospinal fluid on PC12 cell proliferation（±s， n＝6）

3.4 含藥腦脊液對PC12細(xì)胞活性的影響 圖4顯示，與空白組比較，模型組OD值顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組相比，含藥腦脊液組OD值顯著提高 （P＜0.05， P＜0.01）。

3.5 含藥腦脊液對PC12細(xì)胞膜通透性的影響

3.5.1 細(xì)胞存活率 圖5顯示，模型組細(xì)胞存活率顯著低于空白組 （P＜0.05，P＜0.01），含藥腦脊液組也顯著高于模型組 （P＜0.05，P＜0.01）。

3.5.2 LDH活性 圖6顯示，與空白組比較，模型組LDH活性顯著提高 （P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，含藥腦脊液組其水平顯著降低 （P＜0.05， P＜0.01）。

3.6 含藥腦脊液對PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激與NO水平的影響

3.6.1 NO水平 圖7顯示，與空白組比較，模型組NO水平顯著升高 （P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，含藥腦脊液組其水平顯著降低 （P＜0.05，P＜0.01）。

3.6.2 ROS水平 圖8顯示，與空白組比較，模型組ROS熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng) （P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，含藥腦脊液組其熒光強(qiáng)度顯著降低（P＜0.05， P＜0.01）。

圖3 PC12細(xì)胞形態(tài)變化 （×200）Fig.3 Morphological changes of PC12 cells（×200）

圖4 含藥腦脊液對PC12細(xì)胞活性的影響 （±s， n＝6）Fig.4 Effect of medicated cerebrospinal fluid on PC12 cell viability（±s， n＝6）

3.6.3 含藥腦脊液對SOD活性、MDA水平的影響 圖9～10顯示，與空白組比較，模型組SOD活性顯著降低，MDA水平顯著升高 （P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，含藥腦脊液組前者顯著升高， 后者顯著降低 （P＜0.05， P＜0.01）。

3.7 含藥腦脊液對ATP酶活性的影響 圖11顯示，與空白組比較，模型組ATP酶活性顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，含藥腦脊液組中其水平顯著升高 （P＜0.05，P＜0.01）。

圖5 含藥腦脊液對PC12細(xì)胞存活率的影響 （±s， n＝6）Fig.5 Effect of medicated cerebrospinal fluid on PC12 cell survival rate（±s， n＝6）

圖6 含藥腦脊液對LDH活性的影響 （±s， n＝6）Fig.6 Effect of medicated cerebrospinal fluid on LDH activity（±s， n＝6）

圖7 含藥腦脊液對NO水平的影響 （±s， n＝6）Fig.7 Effect of medicated cerebrospinal fluid on NO level（±s， n＝6）

3.8 含藥腦脊液對游離Ca2＋水平的影響 圖12顯示，與空白組比較，模型組游離Ca2＋水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，含藥腦脊液組其水平顯著降低 （P＜0.05， P＜0.01）。

3.9 含藥腦脊液對PC12細(xì)胞凋亡的影響 圖13顯示，與空白組比較，模型組細(xì)胞凋亡數(shù)顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，含藥腦脊液組其凋亡數(shù)顯著減少 （P＜0.05，P＜0.01）。

圖8 含藥腦脊液對ROS水平的影響 （±s， n＝6）Fig.8 Effect of medicated cerebrospinal fluid on ROS level（±s， n＝6）

圖9 含藥腦脊液對SOD活性的影響 （±s， n＝6）Fig.9 Effect of medicated cerebrospinal fluid on SOD activity（±s， n＝6）

圖10 含藥腦脊液對MDA水平的影響 （±s， n＝6）Fig.10 Effect of medicated cerebrospinal fluid on MDA level（±s， n＝6）

4 討論

PC12細(xì)胞為大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系，在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能上與神經(jīng)元極其相似，與原代培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞也具有高度一致性，并有著易于穩(wěn)定培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于神經(jīng)分泌模型建立和神經(jīng)元損傷機(jī)制的研究［11］。

圖11 含藥腦脊液對ATP酶活性的影響 （±s， n＝6）Fig.11 Effect of medicated cerebrospinal fluid on ATPase activity（±s， n＝6）

圖12 含藥腦脊液對游離Ca2＋水平的影響 （±s， n＝6）Fig.12 Effect of medicated cerebrospinal fluid on free Ca2＋level （±s， n＝6）

谷氨酸廣泛存在于許多神經(jīng)元軸突中，在神經(jīng)元分化、生長過程中發(fā)揮重要作用。當(dāng)機(jī)體中谷氨酸濃度過高時(shí)，會對PC12細(xì)胞產(chǎn)生毒害，導(dǎo)致其受體NMDA功能活躍，Na＋、Ca2＋內(nèi)流，細(xì)胞膜電位失衡，導(dǎo)致凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被激活，引起細(xì)胞凋亡。凋亡過程中，線粒體中含有大量攝取內(nèi)流的Ca2＋，導(dǎo)致其濃度過高，降低ATP酶活性，同時(shí)激活NO合成酶，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［12-13］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通竅活血湯含藥腦脊液可增加SOD、ATP酶活性，同時(shí)降低MDA水平。谷氨酸致PC12細(xì)胞損傷時(shí)，可引起氧化應(yīng)激反應(yīng)、ATP衰竭、Ca2＋內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［14-17］，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)20 mmol／L谷氨酸可造成PC12細(xì)胞鈣超載，而通竅活血湯可降低該現(xiàn)象，減輕凋亡發(fā)生。

中藥腦脊液藥理學(xué)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中藥及復(fù)方的一種研究方法，其研究對象是通過腦血管障壁選擇性吸收后的含藥腦脊液，所得結(jié)果在神經(jīng)科學(xué)方面比其他藥理學(xué)方法更準(zhǔn)確可靠。本實(shí)驗(yàn)以含藥腦脊液代替含藥血清，觀察作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物（特別是中藥復(fù)方），可避免血清中復(fù)雜成分干擾，更能體現(xiàn)有效成分藥理作用，增加相關(guān)研究的針對性［18-19］。

綜上所述，通竅活血湯含藥腦脊液可通過降低NO、MDA水平，增強(qiáng) SOD、ATP酶活性，降低ROS生成，減輕鈣超載程度，繼而減輕谷氨酸對PC12細(xì)胞的損傷程度，具有一定保護(hù)作用。

圖13 含藥腦脊液對PC12細(xì)胞凋亡的影響 （±s， n＝6）
Fig.13 Effect of medicated cerebrospinal fluid on PC12 cell apoptosis（±s， n＝6）

注： 與空白組比較，?P＜0.05，??P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

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