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    中藥補(bǔ)肺活血膠囊對(duì)細(xì)顆粒物所致小鼠肺損傷修復(fù)的影響?

    2019-04-01 01:42:48唐詩環(huán)曹乃芹張洪春
    關(guān)鍵詞:染毒顆粒物肺泡

    敬 岳,金 津,唐詩環(huán),曹乃芹,廖 強(qiáng),陳 燕,蔡 哲,張洪春△

    (1. 中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院,北京 100102; 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029; 3. 中日友好醫(yī)院中醫(yī)肺病科,中日友好醫(yī)院呼吸中心;國家呼吸疾病臨床研究中心,北京 100029; 4. 中日友好醫(yī)院臨床研究所,北京 100029)

    細(xì)顆粒物指環(huán)境空氣中空氣動(dòng)力學(xué)當(dāng)量直徑小于等于2.5 μm的顆粒物,具有粒徑小、面積大、活性強(qiáng)的特點(diǎn),容易富集空氣中有毒重金屬、酸性氧化物、有機(jī)污染物以及細(xì)菌和病毒等。細(xì)顆粒物在空氣中停留時(shí)間長、輸送距離遠(yuǎn)且從呼吸道進(jìn)入人體,因此可直接引起呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生。補(bǔ)肺活血膠囊主要藥物組成有黃芪、赤芍、補(bǔ)骨脂,具有益氣活血、補(bǔ)肺固腎的作用。相關(guān)臨床及基礎(chǔ)研究提示,補(bǔ)肺活血膠囊可提高機(jī)體免疫力,緩解慢性支氣管炎及支氣管哮喘疾病患者的相關(guān)臨床癥狀,如咳嗽、咳痰、喘息、心悸、氣短等癥狀[1],也可緩解慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期患者的相關(guān)臨床癥狀[2]。本研究將通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步觀察補(bǔ)肺活血膠囊對(duì)細(xì)顆粒物所致小鼠肺損傷與修復(fù)過程的影響。

    1 材料

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    SPF級(jí)ICR健康雌性小鼠70只,體質(zhì)量18~20 g,由北京華阜康生物科技股份有限公司提供,許可證號(hào)SCXK(京)2014-0004)。在溫度22~28 ℃,相對(duì)濕度50%~60%的清潔環(huán)境中飼養(yǎng),適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,隨機(jī)分為空白對(duì)照組、低劑量染毒組、低劑量染毒中藥組、中劑量染毒組、中劑量染毒中藥組、高劑量染毒組和高劑量染毒中藥組7組各10只。

    1.2 實(shí)驗(yàn)中藥

    補(bǔ)肺活血膠囊組成有黃芪、赤芍、補(bǔ)骨脂,為已上市中成藥補(bǔ)肺活血膠囊,由雷允上藥業(yè)有限公司提供,經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理總局認(rèn)證通過批號(hào)(Z20030063)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

    1.3.1 儀器 Anderson型顆粒物采樣器HBL-GUV(Thermo公司);MK3酶標(biāo)儀(上海雷勃分析儀器有限公司);自動(dòng)控溫離心機(jī)(日本 HITACHI公司);T10 basic型自動(dòng)組織勻漿機(jī)(德國 IKA 公司)。

    1.3.2 試劑 細(xì)顆粒物懸液、KGF抗體(小鼠,英國 Biorbyt公司);免疫組化試劑盒(基因科技(上海)有限公司);IL-4、IL-17 ELISA試劑盒(小鼠,美國R&D公司)。

    2 方法

    2.1 細(xì)顆粒物懸液與補(bǔ)肺活血中藥溶液制備

    細(xì)顆粒物采集于2011年12月至2012年1月北京四環(huán)路中段保福寺橋和學(xué)院橋之間,用Anderson型顆粒物采樣器HBL-GUV(Thermo公司)采用聚四氟乙烯濾膜采樣細(xì)顆粒物,采樣器安置于距道路寬2 m,距地面高1.8~2.5 m處,連續(xù)2周, 將載有顆粒物的濾膜剪裁成1 cm×3cm 大小, 浸入去離子蒸餾水中, 超聲振蕩40 min×3次,洗脫顆粒物, 震蕩液經(jīng)6層紗布過濾, 濾液4 ℃、12000 r min 離心30 min, 收集下層懸液冷凍真空干燥、 稱重,低溫冰箱保存?zhèn)溆谩S蒙睇}水配成所需濃度后超聲震蕩15 min,混勻并滅菌 4 ℃保存,臨用前振蕩使顆粒物充分混勻。相關(guān)研究表明,我國細(xì)顆粒物水溶性無機(jī)成分主要有NO-、SO2-、NH+4、Cl-、K+[4-5]。補(bǔ)肺活血中藥溶液制備:去除膠囊外殼將補(bǔ)肺活血膠囊內(nèi)藥粉按照一定比例與20 ℃蒸餾水充分溶解。

    2.2 模型建立與干預(yù)方法

    空白對(duì)照組:分別于模型建立第1、8、15和22天經(jīng)鼻腔滴入0.9%生理鹽水(20 μL/只),其余時(shí)間正常飼養(yǎng)。細(xì)顆粒物低劑量染毒組、中劑量染毒組、高劑量染毒組:分別于模型建立第1、8、15和22天經(jīng)鼻腔滴注細(xì)顆粒物懸液1.6 mg/ kg·bw,20 μL/只; 8 mg/ kg·bw,20 μL/只;40 mg/ kg·bw,20 μL/只;中藥干預(yù)組:低劑量染毒中藥組、中劑量染毒中藥組、高劑量染毒中藥組經(jīng)鼻腔滴注顆粒物劑量分別與低劑量染毒組、中劑量染毒組、高劑量染毒組相同。

    干預(yù)方法:空白對(duì)照組正常飼養(yǎng)。細(xì)顆粒物低劑量染毒組、中劑量染毒組、高劑量染毒組第1天至第22天,經(jīng)口灌服0.9%生理鹽水0.2 ml/只/d。低劑量染毒中藥組、中劑量染毒中藥組、高劑量染毒中藥組第1天至第22天,經(jīng)口灌服補(bǔ)肺活血中藥溶液(0.82 g/kg, 0.2 ml/只/d),各個(gè)試驗(yàn)組均在最后1次染毒后48 h內(nèi)處死。

    2.3 取材與指標(biāo)檢測

    2.3.1 病理學(xué)分析 脫頸處死小鼠,開胸暴露胸腔,分離靠近肺門處的左肺上葉固定于10%甲醛溶液24 h,常規(guī)脫水石蠟包埋,切片行HE染色,光鏡下觀察。

    2.3.2 免疫組化 肺組織切片常規(guī)脫蠟后,按照免疫組化試劑盒具體操作步驟進(jìn)行檢測。采用美國Media Cybernetics公司生產(chǎn)的Image-Pro Plus圖像分析軟件進(jìn)行分析,以累積光密度(Integrated Optical Density,IOD)反映蛋白表達(dá)總量。

    2.3.3 ELISA檢測 取0.1 g右側(cè)肺葉組織放入1.5mlEP管中,制備成10%肺組織勻漿液,離心 4 ℃,12000 r/min,20 min取上清。按ELISA試劑盒提示的操作步驟說明進(jìn)行肺組織勻漿上清液中相關(guān)炎性介質(zhì)含量。

    2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    3 結(jié)果

    3.1 中藥補(bǔ)肺活血膠囊對(duì)細(xì)顆粒物模型小鼠肺組織病理損傷影響

    圖1顯示,HE染色后觀察小鼠肺組織,空白對(duì)照組小鼠肺組織中肺泡結(jié)構(gòu)較為完整,肺泡間隔無明顯增寬,炎性細(xì)胞未見異常增多,肺泡腔及血管腔中未見明顯出血現(xiàn)象,肺組織內(nèi)氣道結(jié)構(gòu)相對(duì)完整,氣道黏膜未見明顯脫落及損傷(A1)。細(xì)顆粒物模型小鼠肺泡腔明顯變小,肺泡間隔明顯增寬(圖中藍(lán)色箭頭指示),肺泡間隔斷裂肺泡融合明顯,肺泡內(nèi)可見明顯滲出及紅細(xì)胞浸潤(圖中綠色箭頭),肺間質(zhì)可見炎性細(xì)胞浸潤,肺組織內(nèi)氣管可見少量氣道黏膜上皮細(xì)胞脫落(圖中黑色箭頭指示)。且細(xì)顆粒物模型小鼠肺損傷程度可隨染毒劑量加大逐漸加重(A2、A4、A6)。經(jīng)補(bǔ)肺活血膠囊干預(yù)后,細(xì)顆粒物模型小鼠肺泡腔較前明顯增大,肺泡間隔較染毒模型小鼠變薄,肺泡間隔內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤程度減輕;肺泡內(nèi)及肺組織間隙紅細(xì)胞滲出明顯減少,氣管及終末細(xì)支氣管中氣道黏膜較為完整,未見明顯黏膜細(xì)胞脫落及氣道重塑(A3,A5,A7)。經(jīng)補(bǔ)肺活血膠囊干預(yù)后,細(xì)顆粒物模型小鼠肺部炎性損傷及滲出明顯緩解(A1-A7)。

    注:圖中藍(lán)色箭頭指示肺泡間隔明顯增寬,圖中綠色箭頭指示肺泡內(nèi)可見炎性滲出及紅細(xì)胞浸潤,黑色箭頭指示肺間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤及肺組織內(nèi)氣道黏膜上皮細(xì)胞脫落圖1 各實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織HE染色結(jié)果 (×200)

    注:圖中黑色箭頭指示的褐色顆粒物為KGF表達(dá)位置。C1-C3各實(shí)驗(yàn)組中KGF蛋白表達(dá)總量與染毒模型組的比較:**P<0.01,*P<0.05。C4 中各實(shí)驗(yàn)組KGF蛋白表達(dá)總量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義圖2 各實(shí)驗(yàn)小組小鼠肺組織中KGF免疫組織化學(xué)染色及KGF蛋白總量表達(dá)比較

    3.2 中藥補(bǔ)肺活血膠囊對(duì)細(xì)顆粒物模型小鼠肺組織中 KGF表達(dá)及含量的影響

    圖2顯示,角質(zhì)細(xì)胞生長因子(keratinocye growth factor KGF)免疫組織化學(xué)染色后可見KGF(棕色顆粒物)主要分布于肺泡壁內(nèi)側(cè),肺泡與肺泡之間的組織間隙中有組織損傷的部位。空白對(duì)照組中,KGF主要表達(dá)于氣管壁內(nèi)側(cè),柱狀上皮細(xì)胞(B1)。肺泡結(jié)構(gòu)相對(duì)完整,肺泡及肺泡間組織中未見KGF大量表達(dá)。細(xì)顆粒物模型小鼠組中模型小鼠肺泡變小,肺泡間隔增寬,肺泡間組織中KGF表達(dá)明顯增多,隨染毒劑量的增加KGF在小鼠肺組織中的表達(dá)明顯增多 (B2,B4,B6)。經(jīng)補(bǔ)肺活血膠囊干預(yù)后小鼠肺組織中肺泡腔明顯增大,肺泡間隔變窄,肺間質(zhì)中KGF的表達(dá)明顯降低(B3、B5、B7)。經(jīng)補(bǔ)肺活血膠囊干預(yù)后小鼠肺組織結(jié)構(gòu)較前明顯好轉(zhuǎn),KGF分泌明顯降低,小鼠肺組織修復(fù)過程緩解。通過半定量檢測計(jì)算KGF在肺組織中的含量可知經(jīng)補(bǔ)肺活血膠囊干預(yù)后肺組織中KGF蛋白表達(dá)總量明顯低于染毒組(C1-C3),但不同染毒劑量組模型小鼠肺組織中KGF蛋白表達(dá)總量未見明顯差異(C4)。

    3.3 實(shí)驗(yàn)組中小鼠肺組織中IL-4、IL-17表達(dá)

    表1顯示,與空白組比較細(xì)顆粒物染毒組中IL-4、IL-17在小鼠肺組織中的含量顯著增多(P),且隨染毒劑量的增加IL-4、IL-17的表達(dá)進(jìn)一步升高;經(jīng)補(bǔ)肺活血膠囊干預(yù)后,IL-4、IL-17在肺組織中的表達(dá)明顯下降(P)??紤]經(jīng)補(bǔ)肺活血膠囊干預(yù)后小鼠肺組織中的炎性介質(zhì)表達(dá)明顯下降。

    4 討論

    不同粒徑顆粒物可引發(fā)不同部位的損傷,顆粒物粒徑越小進(jìn)入組織的部位越深。因此,細(xì)顆粒物主要進(jìn)入支氣管并深入肺部,最終可導(dǎo)致支氣管哮喘急性發(fā)作,誘發(fā)支氣管炎癥及肺癌等呼吸系統(tǒng)疾病[6]。本研究明確了經(jīng)鼻腔滴注細(xì)顆粒物懸液可以成功獲得模型小鼠肺部損傷的模型,細(xì)顆粒物模型小鼠肺損傷主要表現(xiàn)為小氣道、肺泡及肺間質(zhì)的炎性病變。IL-4是T細(xì)胞自身分泌的生長因子,會(huì)產(chǎn)生免疫紊亂進(jìn)而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生[7-8]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,補(bǔ)肺活血膠囊可以降低細(xì)顆粒物模型小鼠肺組織中IL-4的分泌,考慮補(bǔ)肺活血膠囊可通過調(diào)節(jié)免疫機(jī)制影響炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。IL-17是多種炎癥反應(yīng)的起始因子,可促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞增殖,促進(jìn)炎癥募集[9]。補(bǔ)肺活血膠囊可有效抑制肺組織內(nèi)IL-17的分泌,從而延緩細(xì)顆粒物對(duì)組織造成的炎性損傷,緩解炎癥反應(yīng)過程。KGF是由γδT細(xì)胞的相關(guān)因子合成,可以刺激上皮細(xì)胞增殖、分化、遷移,以促進(jìn)黏膜修復(fù)完整性的維護(hù)。相關(guān)研究表明,KGF與肺纖維化有一定相關(guān)性[12]。補(bǔ)肺活血膠囊通過減少KGF在肺組織中的表達(dá),減弱肺組織損傷修復(fù)過程,降低肺組織纖維樣變可能。呼吸系統(tǒng)疾病多是由于炎性、炎癥損傷、損傷后修復(fù)、纖維化的一系列病理反映過程,最終影響肺組織的整體結(jié)構(gòu)和功能。通過研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)肺活血膠囊可通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵炎癥因子的釋放,緩解細(xì)顆粒物所致的炎癥反應(yīng),從而減弱損傷修復(fù)所致的肺組織結(jié)構(gòu)變化。

    表1 各組小鼠肺組織勻漿上清液中IL-17、1 L-4含量(pg/ml)比較

    注:與空白組比較:**P,*P<0.05

    補(bǔ)肺活血膠囊由黃芪、赤芍、補(bǔ)骨脂組成。黃芪性甘微溫,歸脾、肺經(jīng),具有益衛(wèi)固表、健脾補(bǔ)中之功;赤芍性苦微寒,歸肝經(jīng),具有清熱涼血、散瘀止痛之效;補(bǔ)骨脂性溫,歸腎、脾經(jīng),具有納氣平喘、補(bǔ)腎壯陽之功,故補(bǔ)肺活血膠囊具有補(bǔ)肺固腎、活血化瘀的功效。方中黃芪、補(bǔ)骨脂可調(diào)補(bǔ)肺腎,肺主氣,腎主攝納,故可使在體之氣固守于外,在內(nèi)之氣固攝于內(nèi)。相關(guān)臨床研究表明,補(bǔ)肺活血膠囊可明顯改善COPD患者的肺功能[1-3],緩解矽肺患者肺部的炎性及氧化應(yīng)激反應(yīng)[10]。補(bǔ)肺活血膠囊中黃芪、補(bǔ)骨脂均可增強(qiáng)機(jī)體抵抗能力[11-12],這與中醫(yī)正氣內(nèi)存邪不可干的理論相吻合,與建立小鼠模型的同時(shí)給予中藥干預(yù)和中醫(yī)治未病理論相符。中醫(yī)理論認(rèn)為空氣中細(xì)顆粒物即為外邪,結(jié)合顆粒物性質(zhì)空氣中顆粒物為陰邪、寒濕邪,為疫戾之氣。由于外邪入侵機(jī)體出現(xiàn)正邪相爭,正氣盛則邪氣難以入侵,邪氣盛則為病??諝庵屑?xì)顆粒物首犯機(jī)體肺衛(wèi),使氣血運(yùn)行失司,因此可見痰濁瘀血停滯體內(nèi)。扶助正氣是防止疾病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié),補(bǔ)肺活血膠囊中黃芪、補(bǔ)骨脂均可補(bǔ)益正氣,赤芍則可活血通經(jīng)以防痰濁瘀血內(nèi)停。補(bǔ)肺活血膠囊在提高機(jī)體免疫力、增強(qiáng)機(jī)體正氣的同時(shí),可以預(yù)防疾病的發(fā)生發(fā)展,以達(dá)到“治未病”的目的,該研究也可為防治顆粒物所致呼吸系統(tǒng)疾病提供新的研究思路和方向。

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