油茶籽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物及其抗氧化能力

楊 楠 羅 凡 費學謙 鐘海雁

(1. 中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400；2. 中南林業(yè)科技大學食品學院，湖南 長沙 410004)

美拉德反應(yīng)(maillard reaction，MR)是食品中的還原糖與氨基酸之間發(fā)生的非酶褐變反應(yīng)[1]，該反應(yīng)會產(chǎn)生美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(maillard reaction products，MRPs)，其中包括早期的揮發(fā)性化合物，中間產(chǎn)物和大分子量的聚合物[2]。美拉德反應(yīng)不僅會改善食品的色澤和風味，也會產(chǎn)生抗氧化性物質(zhì)[3]。

Durmaz等[4]研究了焙烤對杏仁油氧化穩(wěn)定性和抗氧化能力的影響，結(jié)果表明：180 ℃下，隨著焙烤時間延長，杏仁油氧化穩(wěn)定性和抗氧化能力呈增強趨勢，得出可以通過適當?shù)暮婵緛砀纳朴托詧怨头N子的保質(zhì)期。陳海光等[5]研究了模式美拉德體系產(chǎn)物對油脂抗氧化性能的影響，結(jié)果表明制得的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物向油脂中添加1%，測得油脂的抗氧化性最好。李志曉[6]研究了加工過程對油茶籽油微量營養(yǎng)成分和抗氧化性的影響，結(jié)果表明，130 ℃下發(fā)生美拉德反應(yīng)的熱榨油茶籽油對DPPH、ABTS、ORAC和FRAP 4種自由基的清除能力最強，抗氧化性最強。

油茶籽在生產(chǎn)和壓榨過程中會經(jīng)過剝殼、破碎、蒸炒[7]等高溫工藝，具有產(chǎn)生美拉德反應(yīng)的溫度條件。油茶籽油中含有氨基酸和還原糖等營養(yǎng)成分[8]，因此具有發(fā)生美拉德反應(yīng)的底物。本試驗擬對油茶籽油中美拉德反應(yīng)發(fā)生的溫度條件，美拉德反應(yīng)發(fā)生的指標及其產(chǎn)物含量與抗氧化性進行探索，以期研究油茶籽油在加工過程中物化特性的變化規(guī)律，為優(yōu)化油茶籽油加工工藝以及油茶籽油營養(yǎng)品質(zhì)及抗氧化性的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

自動液壓榨油機：6YY-190型，洛陽金廈液壓機械有限公司；

紫外分光光度計：UV-2550型，日本島津公司；

電子天平：S-114型，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；

離心機：Avanti J-E型，美國貝克曼庫爾特公司；

分光測色計：CM-3600A型，柯尼卡美能達(中國)投資有限公司；

液相色譜儀：LC-10AT型，日本島津公司；

紫外檢測器：SPD-10A型，日本島津公司。

1.2 樣品與試劑

葡萄糖標準品：純度98%，上海源葉生物科技有限公司；

2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基：純度96%，美國Sigma-Aldrich公司；

羥甲基糠醛(HMF)：純度98%，美國Sigma-Aldrich公司；

3-脫氧奧蘇糖(3-DG)：純度75%，加拿大Toronto Research Chemicals 公司；

乙二醛(GO)：純度60%，加拿大Toronto Research Chemicals 公司；

丙酮醛溶液(MGO)：純度98%，上海麥克林生化科技有限公司；

β-胡蘿卜素：純度96%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

亞油酸(純度95%)、甲醇：HPLC級，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

吐溫-20：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

其他試劑均為分析純；

試驗用水為超純水。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理與提取 選取新鮮成熟的浙江省普通油茶籽經(jīng)干燥后分別經(jīng)過30，60，90，120，150 ℃烘箱加熱處理0，20，40，60 min后分別液壓壓榨得到油茶籽油，冷藏備用，將油茶籽餅粕粉碎、浸提、干燥后冷藏備用。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物提?。悍Q取5 g的油茶籽油，并用甲醇萃取3次后定容至10 mL，取上清液，冷藏備用。

1.3.2 氧化穩(wěn)定時間的測定 按GB/T 21121—2007執(zhí)行。

1.3.3 水分、褐度、色值的測定

(1) 水分測定：按GB 5009.3—2016執(zhí)行。

(2) 褐度的測定：取1 g油茶籽油，加入50%乙醇20 mL，在高速均質(zhì)機作用下，冰浴中提取10 min。提取液于4 ℃、10 000×g離心10 min，過濾脫脂，收集濾液。分別在294 nm處測定美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的紫外吸光度和420 nm處測定美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的吸光值[9]。

(3) 色值的測定：采用投射模式，光路長度為10 mm，測量面尺寸為55 mm×57 mm的光學清潔玻璃制成的比色皿[10]。在儀器校正時，以去離子水作為校正標尺。校正完畢后，取1.3.1中壓榨油20 mL倒入比色皿中，進行測定。

1.3.4 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物測定 采用高效液相色譜法。檢測條件：流動相A為0.1%冰醋酸溶液，流動相B為甲醇；流速0.7 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量10 μL；羥甲基糠醛檢測波長280 nm；二羰基化合物檢測波長314 nm；色譜柱型號ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測器為SPD紫外檢測器；液相色譜洗脫程序如表1、2所示[11]。

表1 羥甲基糠醛的液相色譜洗脫程序Table 1 Liquid chromatographic elution procedure for hydroxymethylfurfural

表2 二羰基化合物的液相色譜洗脫程序Table 2 Liquid chromatographic elution procedure for dicarbonyl compounds

1.3.5 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性

(1) DPPH自由基清除率測定：DPPH法[12]。按式(1) 計算DPPH自由基清除活性。

(1)

式中：

DPPH——自由基清除率，%；

A0——未加MRPS時DPPH溶液的吸光度；

A1——MRPS反應(yīng)一定時間后DPPH溶液的吸光度；

A2——美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度。

(2)β-胡蘿卜素的測定：亞油酸法[13]。按式(2)計算油茶籽油中抗氧化活性系數(shù)(the percent antioxidant activity，AA)。

(2)

式中：

AA——抗氧化活性系數(shù)，%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

各項指標重復測定3 次，運用Excel、SPSS進行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 油茶籽油氧化穩(wěn)定性

油茶籽經(jīng)過不同熱處理后其壓榨油的氧化穩(wěn)定時間如圖1所示。

從圖1可以看出，壓榨油茶籽油的氧化穩(wěn)定時間隨加熱時間的延長呈先增大后趨于平穩(wěn)的變化規(guī)律，在加熱前期(20 min)，氧化穩(wěn)定時間上升最顯著，分別比加熱前增加了2.10，4.46，4.93，5.20，6.17倍；加熱中期(20～40 min)是氧化穩(wěn)定時間緩慢變化期。在所考察的加熱溫度范圍內(nèi)，隨加熱溫度的增加油茶籽油的氧化穩(wěn)定性增強，其中150 ℃加熱60 min 時，油茶籽油的氧化穩(wěn)定時間最長。得出適當加熱處理可以提高油茶籽油的氧化穩(wěn)定性，與Vaidya[14]的研究結(jié)果類似。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物是提高油茶籽油氧化穩(wěn)定性的主要因素，此外還可能有其他物質(zhì)，如茶皂素、多酚、多糖、甾醇、VE等天然抗氧化成分提高了油茶籽油的氧化穩(wěn)定性。

圖1 熱處理后壓榨油茶籽油氧化穩(wěn)定時間的變化

Figure 1 Changes in oxidation stabilization time of pressed oil seed oil after heat treatment

2.2 美拉德反應(yīng)指標

2.2.1 水分 含水量也是研究美拉德反應(yīng)進程的一個指標，油茶籽油加熱前后水分變化如圖2所示。

圖2 美拉德產(chǎn)物水分的變化Figure 2 Changes in the moisture of Maillard products

從圖2可以看出，經(jīng)過不同溫度和時間的加熱可以降低油茶籽油的水分，在加熱初期(20 min)，不同加熱溫度油茶籽油中水分的變化趨勢相同；經(jīng)SPSS分析得知，溫度對油茶籽油水分有極顯著影響，但時間對后者影響不顯著；當在30，60，90，120，150 ℃下加熱1 h后，油茶籽油中的水分分別降至 0.05%，0.08%，0.04%，0.05%，0.04%。因此油茶籽經(jīng)過加熱處理后其水分含量降低，可能會提高茶油的抗氧化性[15]。

2.2.2 褐度 美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物主要是酮類及醛類物質(zhì)，此類物質(zhì)在294 nm處具有特征吸收峰[16]。本研究選取了0，20，40，60 min 4個反應(yīng)時間，在294 nm測定油茶籽油美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物來探討加熱時間對其形成的影響，結(jié)果見圖3。

美拉德反應(yīng)后期產(chǎn)物主要是一類棕褐色的、結(jié)構(gòu)復雜的大分子化合物，油茶籽油美拉德產(chǎn)物在420 nm處的吸光值可以作為美拉德反應(yīng)程度的指標[17]。在420 nm測定油茶籽油美拉德反應(yīng)最終產(chǎn)物來探討加熱時間對其形成的影響，結(jié)果見圖4。

圖3 美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物的變化Figure 3 Changes of the Maillard reaction intermediates

圖4 美拉德反應(yīng)最終產(chǎn)物的變化Figure 4 Changes of the final product of the Maillard reaction

試驗結(jié)果表明，經(jīng)加熱處理后油茶籽的吸光度明顯增加，其中較為明顯的是120，150 ℃。隨著加熱時間的延長，油茶籽油美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在420 nm下的吸光度逐漸增加，溶液顏色加深，表明形成了褐色的聚合體——類黑精。隨著美拉德反應(yīng)時間的延長，產(chǎn)物的抗氧化能力也顯著增強[18]。美拉德反應(yīng)產(chǎn)生中間產(chǎn)物如酮類物質(zhì)和醛類物質(zhì)與最終產(chǎn)物如類黑素均能提高油茶籽油的抗氧化性。

2.2.3 色值 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物并非單一物質(zhì)，而是十分復雜的物質(zhì)體系，所以單一的波長并不能完全反應(yīng)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的真實顏色。本研究通過色差計測定反應(yīng)體系的顏色變化[19](表3)，以期能全面反映美拉德反應(yīng)不同階段產(chǎn)物的色澤指標。

從表3可以看出，隨著反應(yīng)時間的延長L*值、b*值先增大后減少，a*值先減小后增大。隨著加熱時間的延長，油茶籽油顏色逐漸加深，在30，60，90 ℃時40 min之前變化的不是特別明顯，90 ℃在40 min后顏色急劇加深尤其是在150 ℃加熱后顏色比較深。結(jié)果表明，加熱溫度會導致油茶籽油顏色的變化，溫度越高顏色越深；加熱時間也會影響油脂顏色變化，但沒有溫度影響明顯。因為油茶籽油中的磷脂，以及可能混入的蛋白和淀粉均會影響油茶籽油的色澤，其中磷脂通過加熱容易變黑，從而加深油茶籽油的顏色。

表3 美拉德產(chǎn)物色值的變化Table 3 Changes in the color value of Maillard products

2.3 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物及其抗氧化性

2.3.1 美拉德產(chǎn)物含量 在美拉德反應(yīng)的中期反應(yīng)階段形成眾多活性中間體，如羥甲基糠醛[20]、葡萄糖醛酮[21]、3-脫氧奧蘇糖、還原酮類等。美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物二羰基化合物具有很強的抗氧化性，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的二羰基化合物的種類很多，本試驗以3種最常見的二羰基化合物(3-脫氧奧蘇糖、乙二醛、丙酮醛)為研究對象。油茶籽油美拉德產(chǎn)物丙酮醛含量如圖5所示。

圖5 美拉德產(chǎn)物丙酮醛含量Figure 5 Maillard product pyruvic aldehyde content

試驗結(jié)果表明，隨著加熱時間的延長，120，150 ℃下丙酮醛的含量呈先增加后趨于降低，丙酮醛含量降低是因為在加熱20 min后轉(zhuǎn)化成了下一階段的美拉德產(chǎn)物；30，60，90 ℃ 下丙酮醛的含量呈先增加后趨于平緩，丙酮醛含量趨于平穩(wěn)說明90 ℃以下未達到轉(zhuǎn)化為下一階段美拉德產(chǎn)物的溫度。丙酮醛含量在加熱中期(40 min)之前隨著溫度的升高而增加，120，150 ℃在加熱到20 min時含量最多達到0.701，0.760 μg/g，分別是加熱前的3.08，3.35倍。丙酮醛含量與氧化穩(wěn)定時間結(jié)合分析發(fā)現(xiàn)，其含量變化與氧化穩(wěn)定時間變化規(guī)律相似；與抗氧化活性系數(shù)結(jié)合分析，發(fā)現(xiàn)在30 ℃下，線性相關(guān)性最好R2=0.766 3。

油茶籽油中美拉德產(chǎn)物乙二醛、3-脫氧奧蘇糖含量見表4。

表4 美拉德產(chǎn)物乙二醛、3-脫氧奧蘇糖含量?Table 4 Maillard product glyoxal, 3-deoxyosurose content

? “—”為小于最小檢出限。

在150 ℃加熱60 min時油茶籽油中開始檢測出乙二醛和3-脫氧奧蘇糖，含量分別為7.030，1.114 μg/g。而且此時的氧化穩(wěn)定時間也是最高的。

2.3.2 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化性 DPPH自由基清除力可以用于反映物質(zhì)的抗氧化性。加熱前后油茶籽中美拉德反應(yīng)產(chǎn)物清除DPPH自由基的能力見圖6。

由圖6可知，不同反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間提取的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物都具有一定的清除DPPH自由基作用，并且清除自由基能力隨著反應(yīng)時間延長先降低后增加。加熱40～60 min時美拉德產(chǎn)物的自由基清除率顯著增加，在150 ℃下反應(yīng)60 min時達到最高為95.27%。與Sahin等[22]的研究結(jié)果相似，從而證明適當熱處理可以提高抗氧化性。在加熱0～40 min 時，清除自由基能力下降，可能是加熱使油茶籽油中一些天然抗氧化物質(zhì)分解。而在40 min后其清除自由基能力增強，就是因為發(fā)生了美拉德反應(yīng)，其產(chǎn)物具有清除自由基能力。

圖6 美拉德產(chǎn)物清除DPPH自由基能力的變化Figure 6 Maillard products remove DPPH·Capacity changes

由圖7可知，油茶籽油美拉德產(chǎn)物的抗氧化活性隨著加熱時間的延長逐漸增強。其中150 ℃下美拉德產(chǎn)物的抗氧化能力最強，40～60 min時清除自由基能力顯著增加，在反應(yīng)60 min時達到最高為64.17%。其抗氧化能力增強主要是因為在150 ℃下加熱60 min產(chǎn)生了3-脫氧奧蘇糖、丙酮醛、乙二醛等美拉德產(chǎn)物。綜上得出，油茶籽油中3-脫氧奧蘇糖、丙酮醛、乙二醛等美拉德產(chǎn)物能提高其抗氧化能力。

圖7 抗氧化活性系數(shù)Figure 7 Antioxidant activity coefficient

3 結(jié)論

本研究通過測量不同加熱溫度及反應(yīng)時間處理油茶籽油美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)其水分含量隨著時間的延長而減少；而顏色隨著加熱時間延長而加深；相同溫度下加熱時間越長，油茶籽油的氧化穩(wěn)定性越好。采用高效液相色譜測定油茶籽油中的美拉德產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)加熱前后油茶籽油中未檢測到羥甲基糠醛；隨著加熱時間的延長，丙酮醛的含量呈先增加后趨于降低，150 ℃加熱到20 min時含量最多，達到0.76 μg/g，是加熱前的3.35倍。在150 ℃ 加熱60 min時油茶籽油中開始檢測出3-脫氧奧蘇糖和乙二醛，含量分別為1.114，7.030 μg/g。油茶籽油在150 ℃加熱60 min時產(chǎn)生美拉德產(chǎn)物最多且具有明顯抗氧化能力， DPPH自由基清除率為95.27%；抗氧化活性系數(shù)為64.17%。

綜上，油茶籽發(fā)生美拉德反應(yīng)后其產(chǎn)物是具有一定抗氧化性，可能延長油茶籽油的氧化穩(wěn)定性。在油茶籽油中起抗氧化作用的美拉德產(chǎn)物可能是乙二醛、3-脫氧奧蘇糖和丙酮醛等。美拉德反應(yīng)是一個復雜的反應(yīng)體系，MRPs的具體組成及對其的抗氧化物質(zhì)和抗氧化機理有待進一步研究。