有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)腦小血管病大鼠執(zhí)行功能的效果

王茹，劉楠，李衛(wèi)萍，趙弘軼，杜菊梅，黃勇華

1.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心神經(jīng)內(nèi)科，北京市100700；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西咸陽(yáng)市712000

腦小血管病(cerebral small vessel disease,CSⅤD)作為一種日益增長(zhǎng)的醫(yī)學(xué)和社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)而受到關(guān)注。它能夠引起全世界約1/5的腦卒中[1]，是老年人致殘和致死的重要原因[2]。進(jìn)行性的認(rèn)知執(zhí)行功能下降與老年人群中近一半的癡呆相關(guān)[3]。CSⅤD引起認(rèn)知功能障礙主要表現(xiàn)為執(zhí)行功能下降，早期診斷及有效干預(yù)能夠防治CSⅤD相關(guān)的認(rèn)知障礙[4]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，體育鍛煉對(duì)多個(gè)認(rèn)知領(lǐng)域有益，特別是執(zhí)行功能[5]；此外，運(yùn)動(dòng)還可以減緩正常老化中的認(rèn)知功能下降和神經(jīng)變性[6]。

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是一種對(duì)腦和周?chē)M織發(fā)揮多種效應(yīng)的蛋白質(zhì)[7]，在神經(jīng)元生長(zhǎng)、分化、再生和凋亡中發(fā)揮重要作用[8]。在神經(jīng)發(fā)生過(guò)程中，BDNF通過(guò)激活下游原肌球蛋白受體激酶B(tropomyosin receptor kinase B,TrkB)促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)[9]，并具有調(diào)節(jié)突觸的作用[10]。BDNF在神經(jīng)元細(xì)胞的樹(shù)突生長(zhǎng)和形態(tài)學(xué)方面也發(fā)揮重要作用[11]。

有氧運(yùn)動(dòng)可增加大鼠和小鼠齒狀回的神經(jīng)發(fā)生[12]；限制大鼠運(yùn)動(dòng)可損害神經(jīng)發(fā)生，并降低BDNF水平[13]。運(yùn)動(dòng)可恢復(fù)小鼠海馬受損的神經(jīng)發(fā)生水平，并且與BDNF表達(dá)增強(qiáng)相關(guān)[14]。BDNF參與有氧運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)傳導(dǎo)，可以調(diào)節(jié)動(dòng)物和人類認(rèn)知，在神經(jīng)可塑性方面也起重要作用[15]。

本研究探討有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)CSⅤD大鼠BDNF/TrkB信號(hào)通路的影響，以及海馬神經(jīng)元增殖分化和執(zhí)行功能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡健康雄性Sprague-Dawley大鼠48只，體質(zhì)量(350±12.8)g，購(gòu)自北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2016-0002。飼養(yǎng)室溫度20～25℃，相對(duì)濕度50%～65%，環(huán)境保持相對(duì)安靜，12 h光照黑暗交替，自由攝取食水。

本研究由陸軍總醫(yī)院動(dòng)物管理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)，并嚴(yán)格按照國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和動(dòng)物倫理學(xué)要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

冰凍切片機(jī)：德國(guó)LEⅠCA公司。熒光顯微鏡：日本奧林巴斯公司。兔抗BDNF抗體(批號(hào)ab108319)、兔抗TrkB抗體(批號(hào)ab187041)、兔抗Neun抗體(批號(hào)ab177487)、兔抗Ki67抗體(批號(hào)ab15580)：英國(guó)ABCAM公司。小鼠抗雙皮質(zhì)素(doublecortin,DCX)抗體(批號(hào)SC-271390)：美國(guó)SANTA CRUZ公司。高爾基染色液(批號(hào)G1069)、兔抗GAPDH抗體(批號(hào)GB11002)：武漢賽維爾生物科技有限公司。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔ⅠgG二抗(批號(hào)M21002)：艾比瑪特生物醫(yī)藥(上海)有限公司。Alexa Fluor488標(biāo)記的山羊抗兔ⅠgG二抗(批號(hào)A0423)、Alexa Fluor555標(biāo)記的驢抗小鼠ⅠgG二抗(批號(hào)A0460)：上海碧云天公司。

1.3 方法

1.3.1 模型建立及分組

采用雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎法(bilateral common carotid artery occlusion,BCCAO)制備大鼠CSⅤD模型[16]。實(shí)驗(yàn)大鼠編號(hào)，隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、模型組和游泳組，每組16只。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，模型組和游泳組以10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉。大鼠仰臥位，頸正中切口約2 cm，仔細(xì)分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，避免損傷神經(jīng)肌肉，手術(shù)縫線結(jié)扎，關(guān)閉切口。待大鼠蘇醒后回籠飼養(yǎng)。1周后相同方法結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈。

術(shù)后4周，行挖穴試驗(yàn)評(píng)定，如與假手術(shù)組相比挖穴能力有顯著性差異，提示造模成功。

假手術(shù)組大鼠僅分離雙側(cè)頸動(dòng)脈，不結(jié)扎。

1.3.2 訓(xùn)練方案

游泳組大鼠于造模成功后游泳訓(xùn)練4周。游泳池為圓形罐，直徑80 cm，高90 cm，水深60 cm，水溫32～35℃。采用低強(qiáng)度游泳訓(xùn)練[17-18]，每天游泳時(shí)間共2 h，分兩次，之間休息15 min。第1周訓(xùn)練3 d，以后每周增加1 d，共4周。

1.3.3 挖穴試驗(yàn)

BCCAO術(shù)后4周行挖穴試驗(yàn)，評(píng)定造模是否成功；并在每周游泳后行挖穴試驗(yàn)。塑料水管直徑10 cm，長(zhǎng)32 cm，填充沙礫2500 g。管的一端抬離地面6 cm。固定于16:00開(kāi)始測(cè)試，2 h后稱量管內(nèi)剩余的沙礫質(zhì)量作為基線，剩余沙礫用于挖穴能力測(cè)定。次日8:00再次稱量剩余沙礫質(zhì)量。評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)參照Deacon[19]的研究。

1.3.4 Western blotting

挖穴試驗(yàn)測(cè)試完畢后，每組取5只大鼠，斷頭取腦，冰上快速分離海馬組織，稱取50 mg，加入含PMSF的PⅠPA裂解液(1∶500)300 ml中勻漿，4℃、12,000 r/min離心5 min，取上清；加4×蛋白上樣緩沖液，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度；SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜；10%脫脂奶粉封閉2 h，分別加兔抗BDNF一抗(1∶1000)和兔抗TrkB一抗(1∶5000)，4℃過(guò)夜。TBST洗滌3次，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔ⅠgG二抗(1∶6000)室溫2 h，TBST洗滌3次；以GAPDH(1∶2000)為內(nèi)參。辣根過(guò)氧化物酶顯影，Ⅰmage J軟件分析灰度值，以與GAPDH灰度的比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5 免疫熒光染色

每組5只大鼠10%水合氯醛5 ml/kg腹腔注射麻醉，打開(kāi)胸腔，剪開(kāi)右心耳，從左心室灌注4℃生理鹽水約250 ml，待右心耳流出清亮液體時(shí)，換4%多聚甲醛PBS溶液(pH=7.4)灌注約250 ml后取腦組織，海馬區(qū)冰凍切片。高溫抗原修復(fù)，常規(guī)畫(huà)圈，滴加打孔液15 min；10%山羊血清封閉1 h，加兔抗Ki67一抗(1∶100)、小鼠抗 DCX(1∶50)和兔抗 Neun一抗(1∶300)，4℃過(guò)夜；PBS沖洗3次，滴加Alexa Fluor488標(biāo)記的山羊抗兔ⅠgG二抗(1∶500)和Alexa Fluor555標(biāo)記的驢抗小鼠ⅠgG二抗(1∶500)，室溫2 h，PBS沖洗3次，DAPⅠ復(fù)染15 min，10%甘油封片。每只各取1張切片熒光顯微鏡下觀察，Adobe Photoshop CS6軟件中行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.6 高爾基染色實(shí)驗(yàn)

每組6只大鼠斷頭取腦，腦組織于4%多聚甲醛溶液中固定1 d；換高爾基染液，2 d后換新，以后每3天換新，共14 d；15%糖水脫水1 d，30%糖水脫水2 d；蒸餾水洗1 min，濃氨水處理45 min，蒸餾水洗1 min，酸性堅(jiān)膜定影液處理45 min，蒸餾水洗1 min；30%糖水4℃脫水3 d；海馬區(qū)冰凍切片，厚20 μm，光鏡下觀察海馬樹(shù)突發(fā)育情況。選取樹(shù)突長(zhǎng)度相同的海馬神經(jīng)元，用Ⅰmage J 1.52a軟件計(jì)算樹(shù)突棘數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有數(shù)據(jù)均用(xˉ±s)表示。采用單因素方差分析，行方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊，行LSD-t檢驗(yàn)，若不齊行Games-Howell檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 挖穴試驗(yàn)

訓(xùn)練前，模型組和游泳組較假手術(shù)組挖穴能力下降(P＜0.05)。隨著游泳次數(shù)增加，游泳組剩余沙粒數(shù)減少，第3周和第4周，游泳組挖穴能力優(yōu)于模型組(P ＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 BDNF和TrkB蛋白表達(dá)

模型組和游泳組海馬BDNF、TrkB蛋白表達(dá)均較假手術(shù)組下降(P＜0.05)，游泳組高于模型組(P＜0.05)。見(jiàn)圖1、表2。

2.3 Ki67/DCX和Neun表達(dá)

模型組和游泳組Ki67、DCX和Neun陽(yáng)性細(xì)胞率均低于假手術(shù)組(P＜0.05)，游泳組高于模型組(P＜0.05)。見(jiàn)表3、圖2、圖3。

表1 大鼠挖穴試驗(yàn)剩余沙粒質(zhì)量(g)

圖1 大鼠海馬區(qū)Western blotting結(jié)果

2.4 樹(shù)突復(fù)雜性

模型組和游泳組神經(jīng)細(xì)胞樹(shù)突棘數(shù)量均低于假手術(shù)組(P＜0.05)，游泳組高于模型組(P＜0.05)。見(jiàn)表4、圖4。

表2 各組海馬BDNF、TrkB蛋白表達(dá)比較(灰度比)

圖2 大鼠海馬齒狀回Ki67和DCX表達(dá)(免疫熒光染色,×200)

圖3 大鼠海馬齒狀回Neun表達(dá)(免疫熒光染色,×200)

圖4 大鼠海馬區(qū)域樹(shù)突(高爾基染色，×400)

表3 各組海馬Ki67、DCX和Neun陽(yáng)性細(xì)胞率比較

表4 各組海馬神經(jīng)細(xì)胞樹(shù)突棘數(shù)量比較(n)

3 討論

細(xì)胞核增殖相關(guān)抗原ki67是檢測(cè)細(xì)胞增殖的常用指標(biāo)[20]，DCX是在遷移和分化的神經(jīng)元上表達(dá)的一種微管相關(guān)蛋白，主要參與神經(jīng)元前體細(xì)胞的增殖[21]，二者含量增加代表神經(jīng)細(xì)胞增殖再生能力增強(qiáng)。運(yùn)動(dòng)可增加神經(jīng)細(xì)胞分化增殖和樹(shù)突的復(fù)雜性(包括長(zhǎng)度和密度)[22]，樹(shù)突及樹(shù)突棘的數(shù)量越多，接受神經(jīng)元刺激的面積越大，越容易傳導(dǎo)細(xì)胞沖動(dòng)。

本研究顯示，有氧運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)海馬神經(jīng)增殖分化，增加Ki67、DCX的表達(dá)。長(zhǎng)期(6～12個(gè)月)有氧運(yùn)動(dòng)增加前額葉皮層白質(zhì)和灰質(zhì)體積，以及胼胝體連接性[23]，促進(jìn)前額葉皮質(zhì)在認(rèn)知損害中的康復(fù)[24]，中小強(qiáng)度的有氧加力量的混合運(yùn)動(dòng)也能夠促進(jìn)老年大鼠的海馬神經(jīng)發(fā)生[25]。我們推測(cè)，有氧運(yùn)動(dòng)可以使海馬神經(jīng)增殖再生，并改善CSⅤD患者認(rèn)知障礙中海馬相關(guān)的執(zhí)行功能。

運(yùn)動(dòng)誘發(fā)的認(rèn)知收益可能是多種機(jī)制綜合作用的結(jié)果。Etnier等[26]認(rèn)為，心血管健康可能是級(jí)聯(lián)機(jī)制的一個(gè)組成部分，首先有氧運(yùn)動(dòng)可以改善心血管健康，這可能因?yàn)橛醒踹\(yùn)動(dòng)增加血管壁的機(jī)械剪應(yīng)力，上調(diào)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1增加腦血管新生[27]，促進(jìn)腦血液循環(huán)和腦氧合增加，增加血腦屏障通透性，更有效地傳遞神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子[28]。運(yùn)動(dòng)會(huì)激活海馬N-甲基-D-天冬氨酸受體，促進(jìn)BDNF表達(dá)和神經(jīng)發(fā)生[29]，其機(jī)制可能在成熟的海馬齒狀回顆粒神經(jīng)元中產(chǎn)生。顆粒神經(jīng)元增加BDNF的產(chǎn)生，可以激活部分神經(jīng)細(xì)胞上TrkB，通過(guò)觸發(fā)cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)依賴性轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)它們募集到細(xì)胞周期中，增加CREB的磷酸化，并刺激神經(jīng)元類胰島素生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor gene,ⅠGF-1)的攝取；隨著更有效的血流遞送，升高的ⅠGF-1可到達(dá)更多神經(jīng)元，進(jìn)一步增加CREB介導(dǎo)的BDNF表達(dá)[30]。CREB和BDNF在反復(fù)運(yùn)動(dòng)后上升，可促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生，海馬區(qū)神經(jīng)可塑性也隨之增加，引發(fā)功能改善，如執(zhí)行功能和記憶改善[31]。

孫竹梅等[32]發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動(dòng)預(yù)處理可促進(jìn)腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞存活和軸突再生；Lin等[33]發(fā)現(xiàn)，學(xué)習(xí)和記憶任務(wù)的表現(xiàn)隨身體鍛煉而改善；Thacker等[34]也發(fā)現(xiàn)，執(zhí)行功能通過(guò)有氧運(yùn)動(dòng)得到改善；Li等[35]的臨床試驗(yàn)顯示，阻力訓(xùn)練有助于改善老年人的執(zhí)行功能和整體認(rèn)知功能。以上研究均與本研究結(jié)果相似。

對(duì)于某些認(rèn)知領(lǐng)域，如執(zhí)行和記憶，神經(jīng)保護(hù)對(duì)認(rèn)知的客觀改善，要到老年認(rèn)知衰退期才變得明顯，因?yàn)檫@是大腦發(fā)生重大結(jié)構(gòu)變化的時(shí)候[36]。有氧運(yùn)動(dòng)有助于緩解與年齡相關(guān)的認(rèn)知衰退，尤其是與腦血管功能障礙，如CSⅤD相關(guān)的認(rèn)知障礙。