藻-菌系統(tǒng)中微藻生長(zhǎng)條件的響應(yīng)面法優(yōu)化

羅龍?jiān)?，曾凡健，田光?

（1.上饒師范學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江西 上饒 334001；2.浙江大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，杭州 310058）

微藻具有不與農(nóng)作物爭(zhēng)地、生長(zhǎng)周期短和油脂含量高等特點(diǎn)，可作為生產(chǎn)生物質(zhì)能的理想原材料[1]。然而，微藻生長(zhǎng)需要吸收大量的養(yǎng)分，這使得其培養(yǎng)成本較高。因此，很多學(xué)者嘗試采用各種廢水來(lái)培養(yǎng)微藻，既收獲了微藻，又使水質(zhì)得到了凈化[2-6]。與其他處理技術(shù)相比，基于微藻培養(yǎng)的廢水處理技術(shù)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如無(wú)需添加化學(xué)物質(zhì)，具有自產(chǎn)氧及二氧化碳減排能力，生產(chǎn)高附加值生物質(zhì)產(chǎn)品等[7]。

近年來(lái)，很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)將微藻和好氧細(xì)菌共同培養(yǎng)用于廢水處理較微藻單獨(dú)培養(yǎng)更有優(yōu)勢(shì)。這是由于好氧細(xì)菌的存在會(huì)消耗微藻光合作用產(chǎn)生的氧氣，消除因溶解氧過(guò)高對(duì)微藻生長(zhǎng)的抑制，同時(shí)將廢水中有機(jī)物分解成二氧化碳，為微藻光合作用提供碳源[8]。好氧細(xì)菌和微藻的協(xié)同作用不僅可以提高微藻生物量產(chǎn)率，還能省去曝氣操作。而對(duì)于一般的生物處理而言，曝氣所需的成本占到了整個(gè)處理的50%[9]。因此，利用藻-菌系統(tǒng)來(lái)處理廢水能大大降低運(yùn)行成本，且在微藻培養(yǎng)方面具有很大的優(yōu)勢(shì)。目前，有關(guān)藻-菌互作方面的研究主要集中在探明基于微藻的廢水處理系統(tǒng)中存在的優(yōu)勢(shì)微生物，以及廢水中主要成分被吸收或分解的基本機(jī)制方面[10-12]，而對(duì)影響藻-菌系統(tǒng)中微藻生長(zhǎng)的相關(guān)因素研究較少，尤其是它們對(duì)微生物的分解過(guò)程和微藻的光合作用，以及對(duì)廢水中氮磷的遷移轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的影響尚不明確。

本文以對(duì)養(yǎng)豬廢水凈化潛力大的近具刺鏈帶藻（Desmodesmussp.CHXl）為研究對(duì)象，向其中加入對(duì)有機(jī)物降解效果好的商業(yè)化菌劑，人工構(gòu)建藻-菌共培養(yǎng)系統(tǒng)，探討該培養(yǎng)系統(tǒng)的密閉情況及攪拌速率、藻-菌初始接種比例和廢水有機(jī)負(fù)荷對(duì)藻-菌系統(tǒng)中微藻生長(zhǎng)的影響，并對(duì)相關(guān)因素進(jìn)行優(yōu)化，為實(shí)現(xiàn)藻-菌系統(tǒng)對(duì)廢水的資源化利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種及菌種

本文所用的微藻為近具刺鏈帶藻（Desmodesmussp.CHXl），由本課題組從養(yǎng)豬廢水中分離獲得[13]。將微藻在藍(lán)綠藻培養(yǎng)基（medium for blue green algae,BG11）中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，經(jīng)孔徑為1 μm的醋酸纖維濾膜（上海新亞凈化材料有限公司）過(guò)濾后，用超純水洗凈并再次過(guò)濾，備用。

所用的菌劑為對(duì)廢水中有機(jī)物降解效果好的商業(yè)化復(fù)合菌劑（購(gòu)自上海普羅生物技術(shù)有限公司）。菌劑中優(yōu)勢(shì)菌屬為藍(lán)細(xì)菌（Cyanobacteria）、節(jié)桿菌（Arthrobacter）、芽 孢 桿 菌（Bacillus）和 根 瘤 菌（Rhizobium）等。

1.2 廢水

所用廢水為模擬沼液，在BG11培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上改進(jìn)配制而成。其中有機(jī)物、氨氮和總磷主要由無(wú)水乙酸鈉、硫酸銨、磷酸二氫鉀配制而成。模擬廢水的基本理化性質(zhì)為：化學(xué)需氧量（chemical oxygen demand,COD）1 000.01 mg/L、氨氮200.58 mg/L、總氮370.13 mg/L、總磷50.02 mg/L、pH 7.23。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 單因素試驗(yàn)

1）培養(yǎng)系統(tǒng)密閉情況。將藻-菌培養(yǎng)系統(tǒng)設(shè)置為閉合和敞開(kāi)2種形式，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。將微藻和菌劑接種至裝有800 mL廢水（COD為1 000mg/L）的1 000 mL錐形瓶中，置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。其中藻體質(zhì)量濃度為0.1 g/L，菌劑質(zhì)量濃度為10 g/L。敞開(kāi)系統(tǒng)的錐形瓶口呈敞開(kāi)狀態(tài)，閉合系統(tǒng)的錐形瓶口用軟膠塞密封。每個(gè)錐形瓶底部有磁力攪拌器，用于混勻藻液。培養(yǎng)條件為溫度30℃、光照強(qiáng)度100 μmol/（m2·s）、24 h全光照、攪拌速率1 000 r/min。

2）藻-菌接種比例對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響。設(shè)置4個(gè)不同的藻-菌比例處理，其中藻體質(zhì)量濃度為0.1g/L（按干質(zhì)量計(jì)），菌劑質(zhì)量濃度分別為0.1、5、10、20 g/L，對(duì)應(yīng)的細(xì)菌-微藻比例分別為1∶1、50∶1、100∶1、200∶1，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。將微藻和菌劑接種至裝有800 mL廢水（COD為1 000 mg/L）的1 000 mL錐形瓶中（瓶口敞開(kāi)），置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度30℃、光照強(qiáng)度100 μmol/（m2·s）、24 h全光照、攪拌速率1 000 r/min。

3）培養(yǎng)系統(tǒng)攪拌速率對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響。磁力攪拌器的攪拌速率分別設(shè)置為0、1 000、1 500、2 000、2 500 r/min，共5個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。將微藻和菌劑接種至裝有800 mL廢水（COD為1 000 mg/L）的1 000 mL錐形瓶中（瓶口敞開(kāi)），置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。其中藻體質(zhì)量濃度為0.1 g/L，菌劑質(zhì)量濃度均為10 g/L。培養(yǎng)條件為溫度30℃、光照強(qiáng)度100 μmol/（m2·s）、24 h全光照。

4）廢水有機(jī)負(fù)荷對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響。設(shè)置廢水COD分別為1 000、2 000、4 000、6 000、8 000 mg/L，共5個(gè)梯度，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。將微藻和菌劑接種至裝有800 mL廢水的1 000 mL錐形瓶中（瓶口敞開(kāi)），置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。其中藻體質(zhì)量濃度為0.1 g/L，菌劑質(zhì)量濃度均為10 g/L。培養(yǎng)條件為溫度30℃、光照強(qiáng)度100 μmol/（m2·s）、24 h全光照、攪拌速率1 000 r/min。

1.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取藻-菌接種比例、攪拌速率及有機(jī)負(fù)荷為主要影響因素，以微藻生物量為響應(yīng)值，考察各因素間的交互作用對(duì)微藻生物量的影響。采用Design-Expert 7.5軟件進(jìn)行分析，選擇三因素三水平的Box-Behnken設(shè)計(jì)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平如表1所示。將微藻和菌劑接種至裝有800 mL廢水的1 000 mL錐形瓶中（瓶口敞開(kāi)），置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度30℃、光照強(qiáng)度100 μmol/（m2·s）、24 h全光照。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken design

1.4 微藻生物量測(cè)定

通過(guò)測(cè)定近具刺鏈帶藻細(xì)胞數(shù)來(lái)確定其生物量。藻細(xì)胞數(shù)采用血球計(jì)數(shù)板和顯微鏡測(cè)定[14]。微藻生物量（干質(zhì)量，g/L）和微藻細(xì)胞數(shù)之間的擬合關(guān)系為：微藻生物量=1.19×10－7×細(xì)胞數(shù)（R2=0.992 3）。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2013對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的顯著性差異分析利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行，其中開(kāi)放及封閉系統(tǒng)的差異采用配對(duì)樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行分析，其余因素采用單因素方差分析（analysis of variance,ANOVA），顯著水平為0.05。響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用Design-Expert 7.5軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 藻-菌系統(tǒng)中微藻生長(zhǎng)的影響因素分析

2.1.1 培養(yǎng)系統(tǒng)密閉情況對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響

圖1為在開(kāi)放和閉合2種培養(yǎng)方式下藻-菌系統(tǒng)中微藻的生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明，微藻在開(kāi)放系統(tǒng)中的生長(zhǎng)情況優(yōu)于閉合系統(tǒng)（P＜0.05）。培養(yǎng)7 d后，開(kāi)放系統(tǒng)中微藻生物量達(dá)到4.5 g/L，而閉合系統(tǒng)中為4.3 g/L。造成開(kāi)放系統(tǒng)中微藻生物量更高的原因可能是：一方面，開(kāi)放系統(tǒng)中由于培養(yǎng)液和空氣有大面積的接觸，出現(xiàn)高溶解氧抑制微藻生長(zhǎng)的可能性較小[15]；另一方面，在開(kāi)放系統(tǒng)中當(dāng)氧氣或二氧化碳不足時(shí)，可從空氣中獲取，以維持細(xì)菌或微藻的生長(zhǎng)，而在閉合系統(tǒng)中當(dāng)氧氣或二氧化碳不足時(shí)會(huì)影響細(xì)菌或微藻的生長(zhǎng)。開(kāi)放式反應(yīng)器的主要代表是跑道式幅板混合藻類(lèi)塘，現(xiàn)階段98%的商業(yè)化微藻養(yǎng)殖采用此種反應(yīng)器[16]。而密閉式光生物反應(yīng)器由于高昂的設(shè)備及運(yùn)營(yíng)成本未能得到廣泛的應(yīng)用[17]。

圖1 微藻在閉合和開(kāi)放的藻-菌培養(yǎng)系統(tǒng)中的生長(zhǎng)情況Fig.1 Microalgal growth situation in the open and closed algal-bacterial culture systems

2.1.2 藻-菌接種比例對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響

微藻和微生物之間的初始接種比例被認(rèn)為是影響微藻生長(zhǎng)的重要條件之一[15]。本研究設(shè)置了1∶1、50∶1、100∶1、200∶1共4種細(xì)菌-微藻初始接種比例（細(xì)胞數(shù)之比）來(lái)探討它們對(duì)藻-菌系統(tǒng)中微藻生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，微藻生物量隨菌-藻接種比例的增大而增加，當(dāng)菌-藻接種比例為100∶1時(shí)系統(tǒng)中微藻生物量最大，隨后微藻生物量隨菌-藻比例增大而降低（圖2）?？梢?jiàn)，提高菌-藻初始接種數(shù)量有助于微藻生長(zhǎng)，但并非越高越好，在本研究中將菌-藻接種比例控制在100∶1更利于微藻生長(zhǎng)。當(dāng)菌-藻接種比例在適合的范圍內(nèi)時(shí)，廢水中有充足的氧氣供好氧細(xì)菌分解有機(jī)物用，同時(shí)，也會(huì)產(chǎn)生足夠的無(wú)機(jī)碳源用于微藻光合作用，使微藻生長(zhǎng)處于較優(yōu)水平。以上結(jié)果說(shuō)明菌-藻初始接種比例對(duì)微藻生長(zhǎng)有著重要影響，而這種影響又因菌-藻種類(lèi)而異。例如，在小球藻（Chlorellasp.）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）構(gòu)成的藻-菌體系中，對(duì)微藻生長(zhǎng)促進(jìn)效果最好的菌-藻比例為1∶2[18]，而在柵藻和敏捷食酸菌（Acidovorax facilis）共生系統(tǒng)中，有利于微藻生長(zhǎng)的最佳菌-藻比例為1∶3[15]。

圖2 在藻-菌培養(yǎng)系統(tǒng)中微藻在不同細(xì)菌-微藻接種比例條件下的生長(zhǎng)情況Fig.2 Microalgal growth situation under different bacteriamicroalgae inoculation ratios in the algal-bacterial culture system

2.1.3 培養(yǎng)系統(tǒng)攪拌速率對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響

為了提高光能利用率、促進(jìn)氣體交換和提高營(yíng)養(yǎng)有效性，需要對(duì)藻-菌系統(tǒng)進(jìn)行攪動(dòng)混合并使其維持在懸浮狀態(tài)。但是攪拌會(huì)引起湍流和剪切效應(yīng)，從而影響微藻的生長(zhǎng)[19-20]。本研究設(shè)置攪拌速率為0、1 000、1 500、2 000、2 500 r/min 5個(gè)處理來(lái)探討攪拌速率對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，在0～1 500 r/min攪拌速率下，微藻生物量隨攪拌速率的增加而增加，當(dāng)攪拌速率為1 500 r/min時(shí)微藻生物量最大，隨后微藻生物量隨攪拌速率的增加而下降（圖3）。當(dāng)攪拌速率低于1 500 r/min時(shí)，提高攪拌速率會(huì)增加細(xì)胞的養(yǎng)分供應(yīng)并促進(jìn)系統(tǒng)中氧和二氧化碳的交換速率，從而提高微藻的生物量，然而進(jìn)一步提高攪拌速率會(huì)增加剪切力并損傷細(xì)胞，從而使產(chǎn)量迅速降低[21-22]。微藻對(duì)剪切力的敏感度與其是否生有鞭毛相關(guān)，因?yàn)榧羟辛?huì)引起鞭毛損傷，從而導(dǎo)致微藻生長(zhǎng)速率降低[23]。

圖3 在藻-菌培養(yǎng)系統(tǒng)中攪拌速率對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effects of agitating rate on microalgal growth in the algal-bacterial culture system

2.1.4 廢水有機(jī)負(fù)荷對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響

有機(jī)物對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響在很大程度上表現(xiàn)為濃度相關(guān)性，當(dāng)有機(jī)物濃度較低時(shí)能促進(jìn)微藻生長(zhǎng)，而高濃度有機(jī)物則會(huì)抑制微藻生長(zhǎng)[24]。本研究探討了廢水有機(jī)物質(zhì)量濃度（以COD計(jì)）在1 000、2 000、4 000、6 000、8 000 mg/L 5個(gè)梯度下微藻的生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明，當(dāng)廢水初始COD低于2 000 mg/L時(shí)，微藻隨COD升高而增加，當(dāng)廢水初始COD高于2 000 mg/L時(shí)，微藻生物量則隨COD升高而減少（圖4）。說(shuō)明較低濃度的有機(jī)物能促進(jìn)微藻生長(zhǎng)。首先，藻類(lèi)能直接利用有機(jī)物作為生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)源，如磷胺在較低濃度時(shí)可作為碳源和磷源促進(jìn)顫藻的生長(zhǎng)[25]；其次，較低濃度有機(jī)物能促進(jìn)藻細(xì)胞DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成[26]和引起藻細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化程度升高，從而刺激藻細(xì)胞生長(zhǎng)[27]；此外，較低濃度有機(jī)物有利于細(xì)菌將其降解為二氧化碳，為微藻生長(zhǎng)提供碳源。

2.2 藻-菌系統(tǒng)中微藻生長(zhǎng)條件優(yōu)化

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，設(shè)定藻-菌接種比例、攪拌速率和有機(jī)負(fù)荷為優(yōu)化參數(shù)，以微藻生物量為響應(yīng)值，建立響應(yīng)面模型。由表2可知，第11、13、14、15、16號(hào)為區(qū)域中心試驗(yàn)點(diǎn)，其余12組為析因試驗(yàn)點(diǎn)，取值在每個(gè)因素組成的頂點(diǎn)上。零點(diǎn)試驗(yàn)進(jìn)行5次重復(fù)，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。

利用Design-Expert 7.5軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，得到的微藻生物量二次回歸方程為：

圖4 廢水有機(jī)負(fù)荷對(duì)藻-菌培養(yǎng)系統(tǒng)中微藻生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effects of organic load on microalgal growth in the algal-bacterial culture system

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design and results for Box-Behnken

根據(jù)表2結(jié)果，用Design-Expert 7.5軟件進(jìn)行多元回歸分析，回歸方程的方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。該二次多項(xiàng)式回歸模型F值為18.34，P值小于0.01，表明模型極顯著。失擬項(xiàng)F值為4.89，P值為0.079 6，不顯著。模型的調(diào)整確定系數(shù)R2Adj值為0.907 0，說(shuō)明該模型的擬合度良好，試驗(yàn)誤差小，可以用該模型對(duì)微藻的生物量進(jìn)行分析與預(yù)測(cè)。X1、X3、X32對(duì)二次響應(yīng)面模型效果的影響達(dá)到極顯著水平，其余項(xiàng)的的影響則不顯著，說(shuō)明藻-菌接種比例和有機(jī)負(fù)荷對(duì)微藻的生長(zhǎng)影響顯著。

表3 微藻生物量回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of the regression model for microalgal biomass

為確定響應(yīng)面最佳培養(yǎng)條件，運(yùn)用響應(yīng)面尋優(yōu)方法對(duì)回歸方程進(jìn)行最優(yōu)解分析，得到最佳培養(yǎng)條件為菌-藻接種比例150∶1、攪拌速率1 574.29 r/min和有機(jī)負(fù)荷（以COD計(jì)）3 676.02 mg/L。為檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，采用優(yōu)化后的培養(yǎng)條件進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果顯示，培養(yǎng)7 d后，微藻的生物量為（5.68±0.32）g/L，與響應(yīng)面模型得到的理論預(yù)測(cè)值（5.69 g/L）基本吻合。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)藻-菌系統(tǒng)中微藻生長(zhǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳培養(yǎng)條件為菌-藻接種比例150∶1、攪拌速率1 574.29 r/min和有機(jī)負(fù)荷（以COD計(jì)）3 676.02 mg/L。在該優(yōu)化條件下對(duì)微藻進(jìn)行培養(yǎng)，7 d后微藻的生物量達(dá)到5.68 g/L，與理論預(yù)測(cè)值基本吻合。本研究結(jié)果可為提高藻-菌系統(tǒng)對(duì)廢水的資源化利用效率提供科學(xué)依據(jù)。

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