基因突變檢測(cè)及二代測(cè)序在急性髓系白血病預(yù)后分析中的應(yīng)用

李世青 王剛

【摘 要】

影響急性髓系白血?。ˋcute Myelocytic Leukemia，AML）預(yù)后的主要因素包括細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等，同時(shí)近年來二代基因測(cè)序技術(shù)快速發(fā)展并逐漸應(yīng)用于AML診斷及預(yù)后分析，因此本文介紹了二代測(cè)序的發(fā)展歷程以及從單基因檢測(cè)、雙或多基因聯(lián)合檢測(cè)兩方面對(duì)AML預(yù)后分析進(jìn)行綜述。

【關(guān)鍵詞】急性髓系白血病；基因突變；預(yù)后；二代測(cè)序

【中圖分類號(hào)】 R365

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A

【文章編號(hào)】 1672-3783（2019）02-03-001-01

急性髓系白血病（Acute Myelocytic Leukemia，AML）是一類髓細(xì)胞系起源的白血病細(xì)胞在血液、骨髓和其他組織中克隆性增殖的白血病。由于染色體異常以及基因突變等分子遺傳學(xué)或表觀遺傳學(xué)的異常，導(dǎo)致正常的造血系統(tǒng)在定向髓系分化的過程中，在不同階段發(fā)生惡變而引發(fā)血細(xì)胞分化的阻滯，形成不同亞型的血液系統(tǒng)疾病。對(duì)AML預(yù)后的分析，主要集中在細(xì)胞遺傳學(xué)染色體核型分析以及分子生物學(xué)基因檢測(cè)。運(yùn)用二代測(cè)序能夠很好地分析具有預(yù)后意義的基因突變，為預(yù)后分層系統(tǒng)及個(gè)體化治療奠定一定的基礎(chǔ)。

1 AML預(yù)后影響因素

影響AML預(yù)后的因素主要有年齡、性別、初診時(shí)白細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞分化階段以及有無先前的血液學(xué)疾病等一般情況，以及細(xì)胞遺傳學(xué)、分子學(xué)異常。而近年來發(fā)現(xiàn)，通過染色體核型評(píng)估預(yù)后滿足不了臨床需要。分子學(xué)異常研究是指基因突變分析，主要包括FLT3、NPM1、NMT3A、C-KIT、CEBPA、IDH1/2等AML患者中出現(xiàn)頻率較高的體細(xì)胞突變[1]。同時(shí)單基因突變分析仍不足以將占比60%以上的中危核型AML（Intermediate-risk AML，IR-AML）很好地進(jìn)行預(yù)后分層，需納入新的基因及多基因突變組合來進(jìn)一步分層。

2 二代測(cè)序技術(shù)

人類在2004年使用Sanger一代測(cè)序技術(shù)，完成了人類基因組的測(cè)序計(jì)劃，雖然該結(jié)果具有劃時(shí)代意義，但耗時(shí)和高成本限制了其廣泛的應(yīng)用。由于一代測(cè)序的相對(duì)不足以及臨床及科研需要，二代測(cè)序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。新一代測(cè)序技術(shù)（Next generation sequencing， NGS）具有高通量性、快速性、準(zhǔn)確性、費(fèi)用低和信息量豐富等優(yōu)點(diǎn)，研究者可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)基因進(jìn)行精確定位和分析。目前二代測(cè)序的主要技術(shù)平臺(tái)代表有羅氏公司（Roche）的454測(cè)序儀（Roch GS FLX sequencer），Illumina公司的Solexa基因組分析儀（Illumina Genome Analyzer）和ABI的SOLiD測(cè)序儀（ABI SOLiD sequencer）。同時(shí)二代測(cè)序技術(shù)包括全基因組測(cè)序、外顯子測(cè)序及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等。二代外顯子測(cè)序主要用于AML的預(yù)后分析，根據(jù)現(xiàn)有的基因雜交芯片，高效且敏感檢測(cè)多個(gè)基因突變，從而明確診斷和評(píng)估AML的預(yù)后，指導(dǎo)AML治療。

3 單基因突變分析與預(yù)后

3.1 FLT3基因突變與預(yù)后

FLT3突變發(fā)生于近30%的AML，在AML中有兩種常見形式：一種是內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)突變（FLT3-internal tandem duplication，F(xiàn)LT3-ITD），是正常核型AML（Cytogenetically Normal AML， CN-AML）中最常見的一種突變類型；另一種是累及激酶區(qū)活化環(huán)內(nèi)的點(diǎn)突變 （FLT3 tryrosine kinase domain mutation，F(xiàn)LT3-TKD），其最常見于835位天冬氨酸及836位異亮氨酸的突變。除了研究突變存在與否，馬亮等應(yīng)用Illumina的Miseq二代測(cè)序儀對(duì)23例FLT3-ITD陽性AML患者FLT3基因序列進(jìn)行分析，共檢測(cè)到的33條ITD中，17條ITD插入序列為FLT3野生型完全重復(fù)，16條ITD為野生型部分重復(fù)，指出FLT3-ITD序列特征變化較大但突變熱點(diǎn)區(qū)域較為集中于p.Y572位至p.L602位之間[2]。FLT3-TKD突變?cè)贏ML中發(fā)生率為5%～14%。目前FLT3-TKD突變對(duì)預(yù)后的影響尚無一致定論。

3.2 NPM1基因突變與預(yù)后

NPM1基因定位于染色體5q35，編碼核磷蛋白NPM主要定位于核仁區(qū)，野生型NPM主要對(duì)核糖體RNA進(jìn)行加工、控制中心體的復(fù)制、維持基因組的穩(wěn)定。NPM1基因突變后，NPM蛋白C端的氨基酸序列發(fā)生改變，NPM就會(huì)在細(xì)胞質(zhì)中異常堆積。NPM1突變細(xì)胞往往表現(xiàn)為CD34和CD133缺失或低表達(dá)，而CD33分子高表達(dá)[3]。

3.3 DNMT3A基因突變與預(yù)后

DNMT（DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶）是基因DNA甲基化的關(guān)鍵酶，主要類型有DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。近年研究發(fā)現(xiàn)，DNMT3A與AML密切相關(guān)。DNMT3A基因突變存在于14%～36%的AML患者，在FAB分型M4、M5型患者中突變率更高，并與高齡、高白細(xì)胞計(jì)數(shù)、高血小板計(jì)數(shù)呈正相關(guān)。其突變類型R882的錯(cuò)義突變最為常見，常見突變有R882H、R882C等。Ley TJ等的研究表明，存在DNMT3A突變的患者較不存在DNMT3A突變的患者有較短的總體生存率（OS）[4]。Marcucci等的研究結(jié)論進(jìn)一步指出，在CN-AML患者中，年輕（< 60歲）的非R882位點(diǎn)突變患者無病生存期（DFS）、OS縮短，而老年（≥ 60歲）患者存在R882位點(diǎn)突變時(shí)才有相同的結(jié)果[5]。

3.4 C-KIT基因突變與預(yù)后

C-KIT（CD117）是一種原癌基因，位于人染色體4q12-13，是酪氨酸激酶受體蛋白家族的重要成員之一，C-KIT基因突變與急性白血病中的發(fā)病、治療和預(yù)后等密切相關(guān)。丁子軒等用基因測(cè)序方法對(duì)656例中國(guó)AML患者中C-KIT、NPM1、FLT3基因進(jìn)行檢測(cè)并進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)t（8；21）/M2患者常伴有C-KIT的17號(hào)外顯子突變；inv（16）/M4患者常伴有C-KIT的8號(hào)外顯子突變[6]。

3.5 IDH基因突變與預(yù)后

IDH屬于DNA甲基化修飾基因，包括IDH1和IDH2兩種基因，分別位于2號(hào)和15號(hào)染色體。

IDH1突變率為4 %～14%，很少出現(xiàn)IDH1與IDH2共表達(dá)，突變類型多為R132位點(diǎn)突變。

IDH2突變率在AML患者中為3 %～19%，常與高齡、高中危血小板計(jì)數(shù)相關(guān)，其突變位點(diǎn)多在R140，其次是R172，易發(fā)生在AML-M5患者中，易表達(dá)CD34和CD13。R140突變的年輕AML患者預(yù)后良好，OS延長(zhǎng)[7]。IDH1和IDH2突變對(duì)AML預(yù)后的意義還需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

4 多基因突變檢測(cè)與預(yù)后

4.1 FLT3-ITD突變與NPM1突變、DNMT3A突變

FLT3-ITD突變與NPM1突變密切相關(guān)，NPM1突變陽性的AML患者 FLT3-ITD的突變檢出率遠(yuǎn)高于NPM1突變陰性的AML，而伴FLT3-ITD突變 AML M3患者中NPM1突變的檢出率亦高達(dá)60%。FLT3-ITD（-）/NPM1（+）的AML患者對(duì)誘導(dǎo)化療反應(yīng)最好，完全緩解率（CR）最高，若存在FLT3-ITD突變，無論NPM1是否突變，AML患者的CR都會(huì)降低。

研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LT3-ITD、NPM1和DNMT3A突變往往共存發(fā)生，因此其預(yù)后意義也需要聯(lián)合進(jìn)行分析。Hou HA等對(duì)506個(gè)AML患者的研究發(fā)現(xiàn)，DNMT3A的不良預(yù)后意義僅在伴NPM1（+）/FLT3-ITD（+）或NPM1（-）/FLT3-ITD（+）或NPM1（-）/FLT3-ITD（-）的情況下才能凸顯出來，而在伴發(fā)有利基因型 NPM1（+）/FLT3-ITD（-）時(shí)則顯示不出其不良預(yù)后[8]。國(guó)內(nèi)有研究指出，對(duì)95例中危AML患者進(jìn)行常見基因突變分析，發(fā)現(xiàn)5例患者同時(shí)出現(xiàn)FLT3-ITD、NPM1和DNMT3A基因突變，分析指出5例患者化療后均未緩解，并均在6個(gè)月內(nèi)死亡[9]。

4.2 NPM1和IDH1/2同時(shí)突變伴FLT3-ITD陰性

IDH1突變很少與FLT3-ITD共表達(dá)，但出現(xiàn)FLT3-ITD突變時(shí)，累積復(fù)發(fā)率降低，為預(yù)后良好因素，而ITD陰性患者則相反，不過這限制在年輕的AML（非M3）患者中。對(duì)于年輕AML（非M3）患者，當(dāng)FLT3-ITD（-）/NPM1（+）時(shí)，IDH2 R140突變患者的復(fù)發(fā)率比細(xì)胞遺傳學(xué)低危組低；而伴NPM1陰性時(shí)，IDH2 R172突變患者復(fù)發(fā)率與高危組相似[10]。

4.3 CEBPA雙突變/CEBPA單突變與其他基因突變

研究指出，CEBPA單突變相對(duì)CEBPA雙突變來說，更易伴發(fā)基因突變。進(jìn)一步對(duì)伴發(fā)突變基因測(cè)序分析，表明CEBPA單突變更易伴發(fā)DNMT3A、IDH1、IDH2等DNA甲基化修飾基因突變，也會(huì)伴發(fā)具有不良突變意義的基因DNMT3A、FLT3-ITD、TP53的突變，這可能是CEBPA單突變與CEBPA雙突變對(duì)預(yù)后影響不一致的原因[11]。

5 總結(jié)

基因突變檢測(cè)對(duì)AML的預(yù)后評(píng)估具有重要意義。近年來，F(xiàn)LT3-ITD、DNMT3A、C-KIT、CEBPA、NPM1基因突變對(duì)AML預(yù)后評(píng)估的研究基本明確，IDH等基因突變對(duì)預(yù)后的影響還需進(jìn)一步研究證實(shí)。同時(shí)越來越多的基因突變被發(fā)現(xiàn)影響AML預(yù)后，單基因檢測(cè)已經(jīng)遠(yuǎn)不能滿足臨床需求，通過二代測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用對(duì)新基因突變的發(fā)現(xiàn)以及將不同基因突變組合對(duì)預(yù)后進(jìn)行分層，為AML個(gè)體化治療方案奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] Network TCGA. Genomic and Epigenomic Landscapes of Adult De Novo Acute Myeloid Leukemia [J]. New England Journal of Medicine， 2013；368（22）： 2059.

[2] 馬亮，姜永瑋，王少婷，劉倩，叢笑，沈軍，曹永躍，曹永彤.高通量測(cè)序在 FLT3-ITD陽性急性髓細(xì)胞白血病患者中的應(yīng)用[J]中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2016；24（2）：381-387

[3] DE PROPRIS M S，RAPONI S，DIVERIO D，et al.High CD33 expression levels In acute myeloid leukemia cells carrying the nucleophosmin（NPM1）mutation[J].Haema—tologica，2011；96：1548— 1551.

[4] Ley TJ，Ding L，Walter MJ，et a1. DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia. N EngI J Med 2010； 363：2424-33.

[5] Marcucci G， Metzeler KH， Schwind S，et al. Age-related prognostic impact of different types of DNMT3A mutations in adults with primary cytogenetically normal acute myeloid leukemia. J Clin Oncol 2012； 30：742-50.

[6] 丁子軒，沈宏杰，繆競(jìng)誠(chéng)，陳蘇寧，邱橋成，祁小飛，金正明，吳德沛，何軍.C-KIT、NPMl、FLT3基因突變?cè)?56例中國(guó)急性髓系白血病患者中的分布及其對(duì)預(yù)后的影響[J]中華血液學(xué)雜志，2012；33（10）：829-834

[7] 王舒，張赟翔，眭竫旎，魯靜，范惠詠，王 超，陳 冰.正常核型急性髓細(xì)胞白血病中 CEBPA 基因伴隨突變模式分析[J].診斷學(xué)理論與實(shí)踐，2017；16 （5 ）：498-503

[8] Hou HA， Kuo YY，Liu CY，et al. DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia： stability during disease evolution and clinical implications. Blood 2012； 119：559-6，8.

[9] 唐善浩.基因突變與急性白血病預(yù)后關(guān)系分析及二代測(cè)序的臨床應(yīng)用研究[D].蘇州：蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)科學(xué)（血液內(nèi)科），2017；1-97

[10] GREEN C L，EVANS C M，ZHAO L，et al.The prognostic significance of IDH2 mutations in AML depends on the location of the mutation[J].Blood，2011；118：409— 412.

[11] 王舒，張赟翔，眭竫旎，魯靜，范惠詠，王 超，陳 冰.正常核型急性髓細(xì)胞白血病中 CEBPA 基因伴隨突變模式分析[J].診斷學(xué)理論與實(shí)踐，2017；16 （5 ）：498-503