莪術(shù)揮發(fā)油對人宮頸癌裸鼠移植瘤血管生成VEGF通路的研究

周俊

【摘 要】

目的：探討莪術(shù)揮發(fā)油對人宮頸癌裸鼠移植瘤血管生成VEGF通路的可能作用機(jī)制。方法： 對處死裸鼠剝?nèi)∧[瘤標(biāo)本檢測瘤重、瘤體積，計(jì)算抑瘤率；采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測VEGFR-2、VEGF-C的蛋白表達(dá)。結(jié)果：莪術(shù)油高、中劑量組VEGF-C的表達(dá)較模型組顯著降低； 莪術(shù)油高、中、低劑量組VEGFR-2的表達(dá)較模型組降低。 結(jié)論：莪術(shù)油對人宮頸癌hela細(xì)胞裸鼠移植瘤的血管生成有明顯的抑制作用。

【關(guān)鍵詞】莪術(shù)油；hela細(xì)胞；血管生成；裸鼠；VEGF

【中圖分類號】 R197.3

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】 A

【文章編號】 1672-3783（2019）02-03-063-01

腫瘤是一種超過正常限度生長的組織，而其新生血管的形成對腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移具有重要意義。血管生成是指活體組織在已經(jīng)存在的微血管床上芽生出新的以毛細(xì)血管為主的血管系統(tǒng)的過程。有別于胚胎時(shí)期由早期內(nèi)皮細(xì)胞分化形成新血管的過程即血管形成（vasculogenesis）[1]。腫瘤血管生長可分為前血管期（avascular phase）和血管期（vascular phase）。在前血管期，腫瘤細(xì)胞主要依靠彌散供養(yǎng)以及排泄廢物。這個(gè)時(shí)期腫瘤細(xì)胞增殖迅速，但是增殖與凋亡處于動態(tài)平衡，腫瘤直徑不超過1～2mm，可保持?jǐn)?shù)月或數(shù)年不發(fā)生轉(zhuǎn)移。當(dāng)腫瘤組織直徑大于1cm后，被激活的腫瘤組織通過“自分泌”或“旁分泌”機(jī)制合成和分泌血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial cell growth factor， VEGF），促進(jìn)腫瘤周圍組織建立起豐富的毛細(xì)血管網(wǎng)，有利于腫瘤細(xì)胞在新的部位生長及增殖[2]，這就是血管期。本研究通過人宮頸癌裸鼠移植瘤模型治療實(shí)驗(yàn)，評價(jià)莪術(shù)油有效提取物治療人宮頸癌的有效性，初步探討莪術(shù)油有效提取物的動物體內(nèi)抗宮頸癌的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株、動物及藥物：人宮頸癌Hela細(xì)胞株，購自武漢大學(xué)保藏中心。Balb/c-nu品系裸鼠，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司。飼養(yǎng)于貴陽醫(yī)學(xué)院動物中心SPF級動物實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立籠盒飼養(yǎng)系統(tǒng)。溫莪術(shù)藥材購于四川雙流縣溫郁金基地，經(jīng)鑒定為姜科植物溫郁金（Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling）的干燥根莖。采取壓榨粗油經(jīng)水蒸汽精制法制備莪術(shù)揮發(fā)油。陽性藥物5-Fu（5-氟尿嘧啶），購于天津金耀氨基酸有限公司。VEGF-C兔抗人多克隆抗體、VEGFR-2兔抗人多克隆抗體、PV9000二步法試劑盒，購于北京中杉金橋。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人宮頸癌裸鼠移植瘤模型的建立

于裸鼠右側(cè)腋部外上方皮膚注射hela細(xì)胞懸液，7d后接種Hela細(xì)胞的裸鼠均出現(xiàn)直徑大約5mm的皮下結(jié)節(jié)，移植瘤模型建立。接種后將已建立皮下移植瘤模型的裸鼠隨機(jī)分為莪術(shù)油低劑量組（8mg/kg）、莪術(shù)油中劑量組（16mg/kg）、莪術(shù)油高劑量組（32mg/kg）、模型組、5-Fu組（20mg/kg），加上正常對照組，共計(jì)6個(gè)實(shí)驗(yàn)組。腹腔注射給藥給藥，共給藥10次，持續(xù)20天。

1.2.2 觀察指標(biāo)

1.2.2.1 移植瘤重量及體積

抑瘤率（%）=（1-治療組平均瘤重/模型組平均瘤重）×100%。根據(jù)V=ab2/2（單位mm3）公式計(jì)算腫瘤體積，繪制瘤體生長曲線。

1.2.2.2 免疫組化法的檢測

取腫瘤組織標(biāo)本，采用PV二步法免疫組化技術(shù)，按照北京中杉金橋試劑盒說明書進(jìn)行操作。VEGF-C、VEGFR-2的陽性表達(dá)均定位于宮頸癌細(xì)胞的胞漿，并呈棕黃色顆粒，根據(jù)平均透光度進(jìn)行測評。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS17.0軟件系統(tǒng)對相關(guān)數(shù)據(jù)資料進(jìn)行分析，計(jì)量資料用x±s表示，各組間兩兩比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 瘤重、瘤體積檢測

莪術(shù)油高、中、低劑量組瘤重與模型組比較明顯減輕，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；高、中劑量組瘤體積與模型組比較顯著縮小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 免疫組化染色結(jié)果

2.2.1 VEGF-C的表達(dá)結(jié)果

各組裸鼠腫瘤組織VEGF-C的表達(dá)，顯微鏡下可見，腫瘤細(xì)胞胞漿中呈棕黃色改變即為陽性改變。平均透光度測量值與免疫組化標(biāo)記表達(dá)程度呈反比關(guān)系，莪術(shù)油高、中、低劑量組VEGF-C平均透光度的結(jié)果與模型組比較顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2.2.2 VEGFR-2的表達(dá)結(jié)果

各組裸鼠腫瘤組織VEGFR-2的表達(dá)，顯微鏡下可見，腫瘤細(xì)胞胞漿中呈棕黃色改變即為陽性改變。平均透光度測量值與免疫組化標(biāo)記表達(dá)程度呈反比關(guān)系，莪術(shù)油高、中劑量組VEGFR-2平均透光度的結(jié)果與模型組比較顯著降低，莪術(shù)油低劑量組VEGFR-2平均透光度的結(jié)果與模型組比較明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.05）。

3 討論

血管生成（angiogenesis）是近年來興起的一個(gè)新的醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，腫瘤的生長浸潤依賴于腫瘤內(nèi)新生血管的形成，這一觀點(diǎn)被認(rèn)為是腫瘤研究領(lǐng)域中一個(gè)新的里程碑。目前發(fā)現(xiàn)的VEGF受體有5種：血管內(nèi)皮生長因子受體-1（VEGFR1，F(xiàn)lt-1）、血管內(nèi)皮生長因子受體-2（VEGFR2，KDR）、血管內(nèi)皮生長因子受體-3（VEGFR3）、神經(jīng)纖毛蛋白-1受體（NP-l）、神經(jīng)纖毛蛋白2受體（NP-2）[3-4]。研究證實(shí)， VEGFR-2在VEGF的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及血管內(nèi)皮生成中起主導(dǎo)作用。 因此， VEGFR-2成為當(dāng)前抗腫瘤血管生成研究中的熱點(diǎn)。宮頸癌復(fù)發(fā)患者的VEGFR-2表達(dá)水平明顯高于原發(fā)者，另外還有人提出，VEGF/VEGFR-2途徑通過新生血管的形成增加腫瘤的轉(zhuǎn)移的結(jié)論[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中有VEGF-C 及其受體VEGFR-2（KDR） 的表達(dá)，但VEGFR-3 主要在間質(zhì)淋巴管表達(dá)。因此提出，VEGF-C作用于腫瘤細(xì)胞上的VEGFR-2（KDR） ，可能直接影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為[6]。

研究結(jié)果顯示在體外荷瘤裸鼠移植瘤中莪術(shù)油高、中、低劑量組VEGF-C平均透光度的結(jié)果與模型組比較顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。VEGFR-2平均透光度的結(jié)果與模型組比較均有降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩者研究結(jié)果在抗腫瘤血管生成方面呈正相關(guān)性。表明莪術(shù)油可能通過下調(diào)VEGF這條信號通路，達(dá)到抗腫瘤血管生成的目的。莪術(shù)油能抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長，其可能作用機(jī)制與下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子VEGF-C和VEGFR-2蛋白的表達(dá)有關(guān)， 血管生成是腫瘤生長轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵步驟，血管生成因子又在其中起了重要作用?？寡苌芍委熥鳛榭鼓[瘤治療的新方法具有廣闊應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)

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