端粒酶檢測新方法研究進(jìn)展

孫麗芳，楊海堂，衛(wèi) 偉*

(1.國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局復(fù)審和無效審理部，北京 100088；2.東南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，江蘇 南京 211189)

端粒和端粒酶在保證細(xì)胞分裂時(shí)染色體的完整復(fù)制、免于退化方面起關(guān)鍵作用。端粒酶是染色體的自然脫落物，能引發(fā)衰老和癌癥。在新細(xì)胞中，細(xì)胞每分裂一次，端粒就縮短一次。當(dāng)端粒不能再縮短時(shí)，細(xì)胞即無法繼續(xù)分裂而死亡。大約90%的癌細(xì)胞都有著不斷增長的端粒及相對來說數(shù)量較多的端粒酶[1-2]。大量研究數(shù)據(jù)證明，端粒酶活性在正常體細(xì)胞中被抑制，正常組織細(xì)胞中幾乎檢測不到端粒酶的活性，但其在腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)，大約90%的癌細(xì)胞如膀胱癌、乳腺癌、胃癌細(xì)胞中可以檢測到高活性的端粒酶[3]。因此，端粒酶作為一種潛在的腫瘤標(biāo)志物，其檢測對癌癥的預(yù)防、早期發(fā)現(xiàn)以及預(yù)后效果的判斷均具有重大意義。

早期的端粒酶活性檢測方主要有端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法(TRAP)[4-6]、端粒重復(fù)序列延伸法[7]、化學(xué)發(fā)光法[8-10]、實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法[11]等。近年發(fā)展起來的很多新的基于各種納米材料和新技術(shù)的高靈敏檢測端粒酶活性的方法，如電化學(xué)檢測法[12-13]、比色法[14]、熒光法[15]、表面增強(qiáng)拉曼光譜法[16]等，為端粒酶的檢測提供了新選擇。本文重點(diǎn)介紹近年發(fā)展的端粒酶檢測新方法。

1 電化學(xué)檢測法

電化學(xué)分析方法作為一種經(jīng)典的分析方法，具有特異性好、操作簡單、儀器價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。近年來，用電化學(xué)分析方法來檢測端粒酶活性的工作[12,17-19]被大量報(bào)道。

基于DNA上的磷酸基團(tuán)可與鉬酸鹽反應(yīng)生成有電化學(xué)活性的磷鉬酸鹽，Wang等[12]建立了一種用于端粒酶活性測定的超靈敏電化學(xué)傳感器。該檢測體系對102～107Hela cells/mL的端粒酶活性有線性響應(yīng)，檢測限為40 Hela cells/mL。Ling等[17]合成了卟啉金屬有機(jī)框架(ProMOF)材料，在表面包裹鏈霉親和素(SA)后得到ProMOF@SA材料，該材料可在接近電極表面時(shí)電催化氧氣發(fā)生還原反應(yīng)，產(chǎn)生電流信號(hào)。該研究通過端粒酶將其引物擴(kuò)增形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，并釋放與引物互補(bǔ)的DNA，互補(bǔ)DNA與修飾在電極表面的發(fā)卡DNA雜交，發(fā)卡DNA上的生物素通過與ProMOF@SA結(jié)合，還原氧氣產(chǎn)生電流，從而實(shí)現(xiàn)端粒酶的檢測。

此外，研究者們還開發(fā)了端粒酶的免標(biāo)記電化學(xué)檢測方法。例如，Liu等建立了一種基于T7核酸外切酶輔助靶循環(huán)的均相、靈敏、快速、簡便的電化學(xué)策略，用于癌細(xì)胞中端粒酶活性的檢測[18]。無端粒酶時(shí)，標(biāo)記有亞甲基藍(lán)(MB)的發(fā)卡DNA遠(yuǎn)離電極表面，MB的電流信號(hào)較弱；有端粒酶時(shí)，端粒酶擴(kuò)增產(chǎn)物與發(fā)卡DNA形成互補(bǔ)雙鏈，T7核酸外切酶切割雙鏈DNA，此時(shí)由于正負(fù)電吸引作用，MB靠近電極表面。該方案中，端粒酶引物可以循環(huán)利用，提高了檢測的靈敏度。Wei等也發(fā)展了一系列免標(biāo)記電化學(xué)檢測端粒酶活性的新方法。他們以DNA正四面探針固定端粒擴(kuò)增引物并將其修飾到金電極表面，端粒酶擴(kuò)增出(TTAGGG)n富G序列形成G-四鏈體后，具有過氧化物類催化活性，可催化苯胺聚合，形成具有電化學(xué)活性的聚苯胺，進(jìn)而可通過示差脈沖伏安法檢測聚苯胺的電化學(xué)信號(hào)來檢測端粒酶活性。該法最低檢測限為1個(gè)細(xì)胞/10 μL，與單鏈端粒引物探針相比，信號(hào)強(qiáng)度提高20倍[20]。此外，他們還設(shè)計(jì)了一種基于氧化鋁納米通道的無標(biāo)記端粒酶活性檢測新方法[21]，以及無標(biāo)記、無電極修飾的檢測端粒酶活性的新方法[22]。

Zhang 等將聚魯米諾-鉑納米(polyluminol-PtNPs)材料修飾在氧化銦錫(ITO)電極表面，利用端粒酶引入修飾的DNA@MSN@PMA作探針，采用電致化學(xué)發(fā)光法檢測了細(xì)胞內(nèi)端粒酶的活性[23]。Feng等利用硫化鎘半導(dǎo)體納米材料(CdS NCs)和魯米諾-金納米復(fù)合材料(L-AuNPs)間的能量轉(zhuǎn)移(ECL-RET)，實(shí)現(xiàn)了端粒酶的活性檢測[24]。Xiong等合成了釕摻雜的金屬有機(jī)骨架，并利用ECL-RET原理實(shí)現(xiàn)了端粒酶的檢測[25]。

2 比色法檢測端粒酶活性

與電化學(xué)檢測相比，比色法通過裸眼觀察溶液顏色及其深淺來判斷有無目標(biāo)物和目標(biāo)物含量，是一種直觀、簡便、易于快速操作的分析檢測方法。與其它分析檢測方法相比，比色法不需要借助于昂貴的儀器，對操作人員的技術(shù)要求不高，因此越來越受到人們的關(guān)注[26-27]。

在K+與hemin的存在下，端粒酶在引物3′端擴(kuò)增出的富含G的DNA序列會(huì)形成hemin-G-四鏈體納米結(jié)構(gòu)，該納米結(jié)構(gòu)具備辣根過氧化物酶催化活性。Freeman等將制備得到的hemin-G-四鏈體用于催化3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，端粒酶含量越多，得到的TMB+越多，進(jìn)而可通過TMB紫外吸收值的變化實(shí)現(xiàn)端粒酶的檢測，其最低檢測限為200 cells/μL[26]。納米金(AuNPs)是一種很好的比色法探針，當(dāng)AuNPs之間距離很遠(yuǎn)時(shí)，溶液呈紅色；當(dāng)AuNPs距離靠近時(shí)，其紫外吸收峰發(fā)生紅移，溶液變成藍(lán)色。Willner等基于左旋半胱氨酸(L-Cysteine)的輔助作用，通過端粒酶擴(kuò)增引物(TS)擴(kuò)增后形成的hemin-G-四鏈體控制AuNPs的聚集和分散，并實(shí)現(xiàn)了端粒酶活性的檢測[27]。Wang等也提出了利用TS修飾AuNPs比色法檢測端粒酶活性的方法[28]。Xia等以雙功能化的金膠為探針，發(fā)現(xiàn)當(dāng)膀胱癌患者尿液中端粒酶活性水平不同時(shí)，該探針可呈現(xiàn)出4種不同的狀態(tài)(藍(lán)色、紫色、紅色及沉淀)[29]。

Wei等研究了hemin復(fù)合的石墨烯(H-GNs)、金納米棒等納米材料在端粒酶檢測中的應(yīng)用。H-GNs在鹽溶液中具有可調(diào)控的分散性和類過氧化氫酶活性。端粒酶活性不同時(shí)，H-GNs團(tuán)聚程度不同，因而催化TMB的顯色程度不同，所以可以通過肉眼觀察溶液顏色的變化來判斷端粒酶含量[30]。他們還提出了一種基于hemin-G-四鏈體類過氧化物酶催化刻蝕金納米棒的方法來比色檢測端粒酶：以金納米棒(GNRs)為探針，端粒酶活性不同，金納米棒被刻蝕的程度不同，其溶液呈現(xiàn)紅、灰、藍(lán)、紫、粉紅等顏色，基于此可實(shí)現(xiàn)對端粒酶的快速、簡單、可視化檢測[31]。

3 熒光法檢測端粒酶活性

熒光法是生物分析中的常用方法，該法可將待測物質(zhì)的有無和含量多少通過熒光信號(hào)輸出的分子光譜峰位置以及強(qiáng)度表示出來。與一般檢測方法相比，熒光法具有靈敏度高、能夠?qū)崟r(shí)原位檢測以及可生物成像等[32-39]等優(yōu)勢。

國內(nèi)外有不少利用熒光法檢測端粒酶活性的研究。Ma等設(shè)計(jì)了能特異性識(shí)別端粒酶，同時(shí)又能夠釋放出廣譜抗腫瘤藥物阿霉素(Dox)的熒光探針，基于此建立的檢測平臺(tái)能夠?qū)崿F(xiàn)端粒酶活性檢測、細(xì)胞成像以及腫瘤治療的一體化[32]。Yang等設(shè)計(jì)了一種基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)原理的探針，用于細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性檢測和細(xì)胞成像研究[34]。他們將修飾有異硫氰酸熒光素(FITC)和四甲基羅丹明(TAMRA)的DNA(該DNA命名為 Flare)作為探針，當(dāng)探針進(jìn)入到含有端粒酶的細(xì)胞中時(shí)，延伸出來的序列將Flare置換出去，形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，F(xiàn)lare離開AuNPs表面。此時(shí)FITC和TAMRA距離很近，且沒有AuNPs的猝滅作用，使得TAMRA熒光信號(hào)大大增強(qiáng)。Ma等發(fā)展了一種基于2-氨基嘌呤無猝滅分子信標(biāo)檢測端粒酶活性的方法。當(dāng)端粒酶引物被擴(kuò)增后，隨著大片段(KF)聚合酶的加入，引物沿著模板延伸，與加入的發(fā)卡DNA形成雙鏈，同時(shí)分子信標(biāo)被T7酶降解，釋放出游離的分子信標(biāo)和引物延伸鏈，引發(fā)下一輪T7外切酶降解。該方法實(shí)現(xiàn)了雙重信號(hào)放大，具有高靈敏度和特異性，在抗腫瘤藥物的開發(fā)方面具有重要意義[35]。

還有一些科學(xué)家設(shè)計(jì)了更為巧妙的免標(biāo)記法檢測端粒酶的活性。Zhou等開發(fā)了一種基于構(gòu)象開關(guān)的端粒酶活性的熒光檢測方法。該法通過使擴(kuò)增產(chǎn)物與無活性的適體分子(Spinach)雜交，觸發(fā)適體的構(gòu)象轉(zhuǎn)換，隨后Spinach與熒光分子結(jié)合，產(chǎn)生綠色熒光，通過加入核糖核酸酶(RNase H)將雜交的雙鏈切掉，釋放端粒酶擴(kuò)增產(chǎn)物，如此循環(huán)利用，可使熒光信號(hào)得到進(jìn)一步增強(qiáng)。該熒光生物傳感器的檢測限為100個(gè)細(xì)胞[39]。此外，Wei等提出了基于TOTO-1對單鏈DNA中G堿基的高靈敏度和高選擇性檢測端粒酶的方法，通過引入ExoⅢ核酸外切酶對引物鏈消化，極大地提高了方法的靈敏度。該方法對端粒酶的檢測范圍為2～4 000 cells/mL，最低檢測限為2 cells/mL[40]。

在熒光檢測法中，原位檢測技術(shù)能夠在活細(xì)胞內(nèi)研究癌癥標(biāo)志物的動(dòng)態(tài)，分析其表達(dá)的機(jī)會(huì)及表達(dá)水平，實(shí)現(xiàn)癌癥標(biāo)志物的快速、靈敏檢測。目前許多研究將納米材料與信號(hào)放大技術(shù)結(jié)合形成納米探針，并以胞吞的形式進(jìn)入細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的原位檢測。如Qian等設(shè)計(jì)了對端粒酶響應(yīng)的介孔硅納米粒子(MSN)探針，并實(shí)現(xiàn)了端粒酶活性的高靈敏檢測以及細(xì)胞成像研究[41]。他們在帶正電荷的MSN孔道上修飾熒光猝滅基團(tuán)2,5-二特丁基對苯二酚(BHQ)和帶正電荷的熒光素，并用DNA鏈對MSN孔道進(jìn)行封堵。端粒酶擴(kuò)增產(chǎn)物通過和封堵DNA雜交，使之從MSN表面脫落，釋放熒光素，產(chǎn)生熒光，該方法可用于細(xì)胞成像。此外，Zhuang等利用聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE)的特性，開發(fā)了一種快速靈敏的生物探針，利用端粒酶將引物擴(kuò)增后形成的帶高密度負(fù)電荷的單鏈DNA，引起AIE分子的聚集誘導(dǎo)發(fā)光，并將其用于細(xì)胞內(nèi)原位成像來檢測端粒酶活性[42]。

4 表面增強(qiáng)拉曼光譜法

表面增強(qiáng)拉曼法光譜(SERS)具有檢測限低、特異性好、操作簡便、待測樣品狀態(tài)不受限制等特點(diǎn)，在生化分析領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[43-44]。

Xu等以AuNPs為材料進(jìn)行DNA自組裝，合成了金字塔型的拉曼探針用于端粒酶活性的檢測和細(xì)胞成像[43]。他們在4個(gè)15 nm左右的AuNPs表面修飾上4條DNA單鏈，并將其和Cy5標(biāo)記的指示探針(RS)以及端粒酶引物(TS)互補(bǔ)配對，組成具有拉曼信號(hào)的檢測探針。端粒酶擴(kuò)增產(chǎn)物可使RS從雙鏈上脫落，拉曼信號(hào)消失。將該探針與含有端粒酶的癌細(xì)胞進(jìn)行孵育，由于AuNPs具有良好的生物相容性并且能夠進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生熒光信號(hào)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了端粒酶的細(xì)胞成像研究。

Eom等構(gòu)建了基于納米孔道金納米線(AuNW)SERS檢測器檢測癌細(xì)胞和組織中端粒酶活性的平臺(tái)[44]。通過在AuNW上濺射沉積Au獲得富含納米空孔道的AuNW，AuNW具有穩(wěn)定的拉曼信號(hào)，而MB是一種可以嵌入G-四鏈體結(jié)構(gòu)的具有拉曼增強(qiáng)效應(yīng)的分子。當(dāng)端粒酶擴(kuò)增的富G序列形成G-四鏈體后，正電性的MB分子嵌入G-四鏈體內(nèi)，增強(qiáng)富含納米孔道AuNW的拉曼信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞和癌癥組織中端粒酶活性的檢測。該方法非常靈敏，最低檢測限可達(dá)0.2個(gè)癌細(xì)胞。

5 局域表面等離子體共振技術(shù)

免標(biāo)記的局域表面等離子共振(LSPR)檢測技術(shù)具有很高的時(shí)空分辨率，能夠進(jìn)行單顆粒水平原位生物過程及化學(xué)反應(yīng)的研究[45-49]。

Liu等建立了基于等離子體共振散射光譜和暗場顯微鏡原位檢測端粒酶活性及細(xì)胞成像的方法。他們利用端粒酶引物將50 nm的金(核)和13 nm的金(衛(wèi)星)組裝制得Au50@Au13復(fù)合探針，該探針在暗場顯微鏡下呈橙色。當(dāng)引物被端粒酶擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物雜交形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，Au50@Au13探針發(fā)生去組裝，探針發(fā)生顯著LSPR位移，散射光由橙色向綠色漸變。該設(shè)計(jì)極大提高了單粒子的檢測靈敏度，檢出限低至1.3×10-13IU，可監(jiān)測藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性變化[50]。

6 結(jié)論與展望

端粒酶是重要的腫瘤生物標(biāo)志物之一，實(shí)現(xiàn)簡單、準(zhǔn)確的端粒酶活性評價(jià)是本領(lǐng)域研究者孜孜不倦的追求。最近幾年，端粒酶活性的檢測新方法已經(jīng)克服了原位端粒酶活性檢測的挑戰(zhàn)，實(shí)現(xiàn)了從體外到活細(xì)胞內(nèi)端粒酶成像的檢測。盡管方法的高靈敏度和方便快捷性尚未能很好的兼顧，穩(wěn)定性方面也有待改進(jìn)，這些方法也還不能直接用于臨床診斷和癌癥患者的藥物治療效果監(jiān)測。然而熒光技術(shù)對端粒酶在活細(xì)胞中的內(nèi)成像做出了巨大貢獻(xiàn)，可以預(yù)期，一些DNA組裝的納米探針，如AuNP/DNA和PtNPs/DNA在抗癌藥物從體外運(yùn)輸進(jìn)入體內(nèi)方面具有巨大的潛力，實(shí)現(xiàn)端粒酶監(jiān)測、腫瘤治療與熒光成像一體仍有很大的研究空間。因此，發(fā)展對端粒酶活性分析的簡單、靈敏、低成本的原位實(shí)時(shí)監(jiān)測仍然是當(dāng)前亟待解決的問題。