磷摻雜碳量子點(diǎn)的分離及其光學(xué)性能研究

雷 云， 黃丹丹， 林新華， 劉愛林

納米碳量子點(diǎn)是一種以碳元素為主體的、具有熒光發(fā)射功能的碳球[1]。碳量子點(diǎn)因粒徑差異可發(fā)射出不同顏色的熒光[2]，因此又稱為熒光碳量子點(diǎn)[3]。熒光碳量子點(diǎn)被近紅外光激發(fā)后，在近紅外光譜范圍內(nèi)可顯示熒光，可應(yīng)用于體內(nèi)納米生物技術(shù)。與傳統(tǒng)的有機(jī)染料和半導(dǎo)體量子點(diǎn)相比，熒光碳量子點(diǎn)因具有低細(xì)胞毒性、高光穩(wěn)定性、良好的化學(xué)惰性和生物相容性等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于生物成像和光催化中[4-5]。在合成碳量子點(diǎn)的大部分方法中，所得產(chǎn)物均存在尺寸、形貌不均一的現(xiàn)象，甚至還包含許多合成中間體及未反應(yīng)的原料[6]，為獲得形貌均勻且尺寸分布窄的碳量子點(diǎn)就需要進(jìn)行分離。因此，將產(chǎn)物分離純化，從而擴(kuò)大其在熒光探針及生物傳感器中的應(yīng)用具有重要的意義。熒光碳量子點(diǎn)的分離具有較大的可控性和靈活性，可以進(jìn)行有目的地分離，既可依據(jù)碳量子點(diǎn)的尺寸，也可根據(jù)碳量子點(diǎn)的極性大小以及表面的電荷量進(jìn)行分離，如聚丙烯酰胺凝膠電泳法、毛細(xì)管電泳法、陰離子交換離子色譜法、反相高效液相色譜法、離心分離法[7-14]。本研究基于熒光碳量子點(diǎn)的極性大小，利用硅膠柱層析色譜對(duì)制備的磷摻雜碳量子點(diǎn)混合物進(jìn)行分離，并對(duì)各組分的光學(xué)性能進(jìn)行研究，為進(jìn)一步獲取高質(zhì)量的熒光碳量子點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 膦甲酸鈉(≥98%，上海阿達(dá)瑪斯公司)；果糖(≥98.5%，美國GENVIEW公司)；硫酸奎寧(99.0%，上海阿拉丁公司)；乙酸乙酯及甲醇(上海泰坦科技股份有限公司)；濃硫酸(98%)及硅膠(200-300目)(上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。上述試劑如無特別說明，均為分析純。

聚四氟高壓反應(yīng)釜(YZ-HR-25ML，北京巖征生物科技有限公司)；紫外可見分光光度計(jì)(UV-2450型，日本島津公司)；熒光分光光度計(jì)(F-4600型，日本日立公司)；紅外光譜儀(Nicolet 380，上海馭锘實(shí)業(yè)有限公司)；電子分析天平(BS110S，德國Sartorius公司)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Neofuge 23R，上海力新儀器有限公司)；鼓風(fēng)干燥箱(BAO-80A，施都凱設(shè)備有限公司)；冷凍干燥器(FD-1-50，天津比朗實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-2000A，上海亞榮生化儀器廠)。

1.2方法

1.2.1磷摻雜碳量子點(diǎn)的制備 稱取果糖1.8 g和膦甲酸鈉1.1 g，加入10 mL去離子水，待樣品完全溶解后，轉(zhuǎn)移至聚四氟高壓反應(yīng)釜內(nèi)，密封。置于烘箱內(nèi)，于200 ℃下反應(yīng)3 h后，關(guān)閉電源，自然冷卻至室溫。將反應(yīng)結(jié)束的樣品溶液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，繼續(xù)向反應(yīng)釜內(nèi)加入5 mL去離子水，充分?jǐn)嚢璩恋砗笠徊⑥D(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，12 000 r/min離心10 min。取上清液，用0.22 μm的濾膜過濾，即得碳量子點(diǎn)溶液。將所得的碳量子點(diǎn)溶液冷凍干燥后用去離子水復(fù)溶成一定濃度的碳量子點(diǎn)溶液。

1.2.2磷摻雜碳量子點(diǎn)的分離 稱取硅膠35.0 g于潔凈的瓷盤上，并置于烘箱中活化，100 ℃恒溫加熱45 min，待活化完畢，降至室溫取出。采用濕法裝柱，以不同體積比的乙酸乙酯-甲醇溶液為洗脫劑，依次進(jìn)行洗脫(溶劑比例依次為100∶0，80∶20，50∶50，20∶80，0∶100)，在洗脫過程中逐漸增加洗脫溶劑的極性，直至樣品被全部洗脫。每個(gè)淋洗梯度依次收集12管洗脫液，每管體積約9 mL，共計(jì)收集60管，并按照流出順序編號(hào)為1～60。收集的洗脫液分別轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1～2 mL，并真空干燥得到熒光碳量子點(diǎn)固體產(chǎn)物，加入一定去離子水，配制成一定濃度的熒光碳量子點(diǎn)溶液。

2 結(jié) 果

2.1硅膠柱色譜分離條件的優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)采用乙酸乙酯-乙醇、乙醇-水、乙酸乙酯-甲醇3種不同的洗脫體系分離碳量子點(diǎn)。以乙酸乙酯-乙醇為洗脫體系，發(fā)現(xiàn)乙醇比例增大至50%時(shí)，樣品才開始被洗脫。該洗脫體系流速慢，樣品色帶遷移速度緩慢，洗脫時(shí)間長，且乙醇比例增大至100%時(shí)，仍有部分樣品未被洗脫。因此，改用洗脫能力大的乙醇-水為洗脫體系，當(dāng)乙醇和水比例為100∶0時(shí)，碳量子點(diǎn)樣品被大量洗脫；當(dāng)二者比例為80∶20時(shí)，觀察到兩條明顯色帶；當(dāng)二者比例為70∶30時(shí)，樣品層幾乎被全部洗脫，不利于樣品收集制備。因此，改乙酸乙酯-甲醇體系作為洗脫體系，分別以100∶0，80∶20，50∶50，20∶80，0∶100的比例梯度依次淋洗硅膠柱。當(dāng)乙酸乙酯含量為100%時(shí)，樣品開始被洗脫；隨著洗脫溶劑極性增大，硅膠柱陸續(xù)出現(xiàn)多條顏色深淺不同的色帶；當(dāng)比例為20∶80時(shí)，柱色譜中大量碳量子點(diǎn)樣品被洗脫；當(dāng)比例為0∶100時(shí)，樣品層幾乎被全部洗脫，收集流出液，測(cè)試每個(gè)組分的光學(xué)性能。

2.2不同洗脫條件下碳量子點(diǎn)熒光性能的考察 分別測(cè)定不同洗脫條件下分離獲得的碳量子點(diǎn)組分的激發(fā)光譜和熒光光譜，不同洗脫組分的發(fā)光性質(zhì)(包括激發(fā)波長和發(fā)射波長)見表1?？梢娤嗤疵摋l件下獲得的組分的激發(fā)波長與熒光發(fā)射波長較為相近，如1～13號(hào)的激發(fā)波長為225～234 nm，發(fā)射波長為380～400 nm。同時(shí)依據(jù)相近的發(fā)光性質(zhì)，將碳量子點(diǎn)組分分成三類(表1)。隨著甲醇的比例增大至50%之后(組分編號(hào)32～60)，收集組分激發(fā)峰和發(fā)射峰基本未發(fā)生位移，且與未分離的碳量子點(diǎn)混合液的激發(fā)峰和發(fā)射峰位置一致(圖1)，該部分碳量子點(diǎn)約占所收集溶液的一半。

2.3碳量子點(diǎn)的紫外光譜和熒光光譜表征 根據(jù)發(fā)光性質(zhì)選取典型組分(編號(hào)分別為10，24，37，極性依次增大)進(jìn)行光譜表征。3個(gè)組分與摻磷碳量子點(diǎn)混合液的紫外-可見吸收光譜圖見圖2A，可見在240～260 nm均有吸收峰。不同組分熒光碳量子點(diǎn)的歸一化熒光光譜圖見圖2B，其中插圖為未分離的碳量子點(diǎn)與3個(gè)組分在365 nm波長的紫外燈下的光學(xué)圖片，未分離的碳量子點(diǎn)原液呈現(xiàn)微弱的淡藍(lán)色熒光，經(jīng)分離得到的3個(gè)熒光碳量子點(diǎn)發(fā)射波長分別為400，432，453 nm，在紫外燈下分別呈現(xiàn)藍(lán)色、黃色、黃綠色熒光。

表1不同洗脫組分的激發(fā)波長和發(fā)射波長

Tab1The maximum excitation and emission wavelengths of the different carbon quantum dots

光學(xué)參數(shù)組分編號(hào)1～1314～3132～60λex (nm)225～234321～330349～358λem (nm)380～400421～433450～461

λex：激發(fā)波長；λem：發(fā)射波長.

λex：激發(fā)波長；λem：發(fā)射波長.圖1 未分離純化的熒光碳量子點(diǎn)混合液激發(fā)光譜和發(fā)射光譜Fig 1 The excitation and emission spectra of original carbon quantum dots

2.4碳量子點(diǎn)的紅外光譜表征 3個(gè)典型組分(編號(hào)分別為10，24，37)的紅外光譜圖見圖2C?？梢?個(gè)組分的紅外光譜相似，具有相同的紅外特征峰，均出現(xiàn)了3 550,1 740,1 151和1 080 cm-1處的特征吸收峰。

2.5熒光量子產(chǎn)率的計(jì)算 熒光量子產(chǎn)率的測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[15]，用五點(diǎn)法測(cè)定組分10,24和37及摻磷碳量子點(diǎn)混合液的熒光量子產(chǎn)率。以硫酸奎寧為參比物質(zhì)，測(cè)量碳量子點(diǎn)和硫酸奎寧的稀溶液在碳量子點(diǎn)最佳激發(fā)波長下的積分熒光強(qiáng)度和吸光度值(應(yīng)小于0.1),計(jì)算熒光量子產(chǎn)率，公式為：

ΦX=ΦST×(GradX/GradST)×(ηX2/ηST2)

其中，ФX為待測(cè)物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率，ФST為已知參比物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率；GradX和GradST分別表示以待測(cè)物質(zhì)和參比物質(zhì)的積分熒光強(qiáng)度與吸光度作圖工作曲線的斜率；ηX和ηST分別表示待測(cè)物質(zhì)和參比物質(zhì)的折光系數(shù)。0.1 mol/L 硫酸奎寧的熒光量子率為54%，0.1 mol/L 硫酸水溶液和碳量子點(diǎn)水溶液的折光系數(shù)相同，均為1.33。通過計(jì)算，發(fā)現(xiàn)硅膠柱層析法分離得到的組分10，24和37的熒光量子產(chǎn)率不同，分別為4.1%，5.2%和7.3%，未分離的碳量子點(diǎn)混合液的熒光量子產(chǎn)率為4.6%。

A：紫外-可見吸收光譜； B：熒光光譜(插圖為其在365 nm紫外燈下的光學(xué)圖); C:紅外光譜圖.圖2 不同碳量子點(diǎn)的紫外光譜、熒光光譜表征及紅外光譜圖Fig 2 The UV-Vis absorption spectra， the fluorescence spectra and FTIR spectra of the different carbon quantum dots

3 討 論

碳量子點(diǎn)的分離具有較大的可控性和靈活性，可對(duì)碳量子點(diǎn)進(jìn)行有目的地分離，比如根據(jù)碳量子點(diǎn)的不同尺寸或者不同性質(zhì)分別采用不同原理的方法將其分離，在分離過程中還能去除反應(yīng)過程中的原料以及副產(chǎn)物，以實(shí)現(xiàn)對(duì)碳量子點(diǎn)進(jìn)一步純化的目的。色譜法利用不同物質(zhì)在不同相態(tài)的選擇性分配，用流動(dòng)相對(duì)固定相中的混合物進(jìn)行洗脫，混合物中不同的物質(zhì)會(huì)以不同的速度沿固定相移動(dòng)，最終達(dá)到分離的效果。本實(shí)驗(yàn)以吸附色譜法中應(yīng)用最為廣泛的硅膠為固體吸附劑，將混合物中各組分吸附到吸附劑上，用適當(dāng)溶劑進(jìn)行洗脫，利用不同極性的組分在硅膠表面吸附力不同，從而實(shí)現(xiàn)分離。吸附能力較弱的組分遷移速度快，先被洗脫；吸附能力較強(qiáng)的組分遷移速度慢，后被洗脫。在硅膠柱層析中，洗脫溶劑的恰當(dāng)選擇對(duì)改善分離效果也產(chǎn)生重要的影響，洗脫能力主要由其極性決定。對(duì)于復(fù)雜混合物的分離，可采用二元混合溶劑體系來提高分離的選擇性?？紤]到以果糖和膦甲酸鈉水熱法合成的磷摻雜碳量子點(diǎn)表面帶有極性官能團(tuán)，所選溶劑應(yīng)對(duì)樣品具有一定溶解性。因此，首先以乙酸乙酯這種中等極性溶劑為洗脫體系的主體，以乙醇極性溶劑為改性劑，考察該洗脫體系的分離效果，結(jié)果表明乙酸乙酯-乙醇洗脫體系對(duì)于碳量子點(diǎn)的洗脫強(qiáng)度太弱，同時(shí)由于乙醇的黏度大，降低了組分在兩相間的傳質(zhì)速度，并削弱了柱子的滲透性，導(dǎo)致柱效下降，色譜條帶不清晰，碳量子點(diǎn)樣品也未被完全洗脫。然后選用乙醇-水洗脫體系，當(dāng)改性劑水的含量稍微增加，即可使所有樣品都被洗脫，說明乙醇-水洗脫體系的洗脫能力太強(qiáng)，組分間無法實(shí)現(xiàn)有效分離。最后考察乙酸乙酯-甲醇洗脫體系，洗脫過程中采用極性不斷增加的梯度洗脫方式，通過調(diào)整乙酸乙酯和甲醇的體積比來改變洗脫劑的極性，使碳量子點(diǎn)合成產(chǎn)物中的各個(gè)組分逐漸分開，獲得較為理想的分離效果。

實(shí)驗(yàn)采用硅膠柱層析技術(shù)，以乙酸乙酯-甲醇為洗脫體系分離純化磷摻雜碳量子點(diǎn)，收集60個(gè)組分，通過考察組分的熒光性能，發(fā)現(xiàn)不同極性洗脫條件得到的組分間的激發(fā)波長與熒光發(fā)射波長存在較大差異，且隨著洗脫劑極性的逐漸增大，洗脫得到的碳量子點(diǎn)的激發(fā)波長和發(fā)射波長不斷紅移，且斯托克位移均>90 nm，可有效避免激發(fā)峰與發(fā)射峰的重疊，有利于碳量子點(diǎn)在熒光分析檢測(cè)方面的應(yīng)用。

本研究選取3個(gè)典型組分進(jìn)行紫外光譜表征，不同極性的組分間吸收峰位置略有差異，吸收曲線的形狀與摻磷碳量子點(diǎn)混合液也存在明顯不同。從熒光光譜中可觀察到組分的極性增大，其發(fā)射波長往長波方向移動(dòng)，熒光強(qiáng)度也隨之出現(xiàn)增加趨勢(shì)，說明水熱法合成的碳量子點(diǎn)產(chǎn)物通過硅膠柱層析分離出的不同極性的碳量子點(diǎn)具有不同的光學(xué)性能。

采用紅外光譜對(duì)3個(gè)組分進(jìn)行表征，結(jié)果表明，3個(gè)組分具有相同的紅外特征峰，其中3 550 cm-1處代表-OH特征吸收，1 740 cm-1處歸屬于羧基的C=O的伸縮振動(dòng)，1 151 cm-1和1 080 cm-1分別歸屬于與膦甲酸鈉結(jié)構(gòu)相關(guān)的特征官能團(tuán)P=O和P-O-R。組分10和組分24的3 550 cm-1和1 740 cm-1特征峰尖銳并離散，組分37在這兩處特征峰則寬而集中，說明隨著洗脫劑極性的增強(qiáng)，所得組分表面的-COOH增多，碳量子點(diǎn)的極性增加。

熒光量子產(chǎn)率又稱為熒光效率，是熒光物質(zhì)的重要發(fā)光參數(shù)。因此，本研究還測(cè)定了分離得到組分的熒光量子產(chǎn)率，結(jié)果表明碳量子點(diǎn)極性增大，發(fā)射波長發(fā)生紅移，熒光量子產(chǎn)率也隨之增強(qiáng)，出現(xiàn)分離后組分的熒光量子產(chǎn)率比未分離的碳量子點(diǎn)混合液的熒光量子產(chǎn)率大的現(xiàn)象，這可能是由于混合物中的碳量子點(diǎn)之間發(fā)生了能量共振轉(zhuǎn)移，說明硅膠層析柱可根據(jù)極性不同實(shí)現(xiàn)碳量子點(diǎn)組分的初步分離。

本實(shí)驗(yàn)以果糖和膦甲酸鈉為前驅(qū)體合成磷摻雜碳量子點(diǎn)，并利用硅膠柱層析色譜對(duì)碳量子點(diǎn)混合物進(jìn)行分離純化。經(jīng)過優(yōu)化洗脫條件，選用乙酸乙酯-甲醇洗脫體系對(duì)碳量子點(diǎn)進(jìn)行分離。對(duì)不同洗脫條件下得到的碳量子點(diǎn)樣品進(jìn)行紫外-可見光譜、熒光光譜和紅外光譜表征以及熒光量子產(chǎn)率的測(cè)定。分離后的碳量子點(diǎn)組分具有未分離的碳量子點(diǎn)混合液不同的光學(xué)性能，隨著碳量子點(diǎn)極性的增大，組分的發(fā)射波長逐漸紅移。說明硅膠柱層析可有效分離碳量子點(diǎn)，后續(xù)處理步驟簡單，組分損耗小，成本低，可實(shí)現(xiàn)碳量子點(diǎn)的批量分離純化，為獲得高質(zhì)量的熒光碳量子點(diǎn)提供可能性，有利于其在熒光分析和生物成像等領(lǐng)域中的應(yīng)用。