微觀研究生物降解塑料

塑料由于較低的成本以及理想的化學(xué)、力學(xué)、熱和電等性能，被廣泛用于包裝、醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、電器、汽車以及加工行業(yè)。然而，塑料也是一個大污染源，常在經(jīng)過短期使用之后便被扔進垃圾堆場，全世界的塑料垃圾以每年6000萬t的速度在產(chǎn)生?；诃h(huán)境保護的出發(fā)點，處置塑料的各種措施和方法相繼出現(xiàn)，生物降解路徑便是其中之一。經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（OECD）早先針對化學(xué)品提出“快速生物降解性”的概念，要求在28 d的測試期限內(nèi)的10 d窗口期應(yīng)達到60%生物降解，規(guī)定將10%的生物降解程度定為該窗口期的起點。文獻中已出現(xiàn)幾種具有可比性生物降解的塑料品鐘，如聚己酸內(nèi)酯、己二酸琥珀酸共聚丁二醇酯、聚乳酸、聚丁二酸丁二醇酯等。

生物可降解塑料是微生物的一種碳來源和能源，在有氧條件下的生物降解反應(yīng)可以用方程式（1）來表示：

聚合物的碳（C聚合物）被微生物吸收（轉(zhuǎn)為C生物質(zhì)），而后礦化成CO2和H2O或用于生長和再生產(chǎn)（更多C生物質(zhì)）。C生物質(zhì)經(jīng)較長時間礦化，在土壤微生物種群或儲藏的聚合物的作用下產(chǎn)生CO2。其結(jié)果是CO2的快速生成后，接著是較慢第二階段的CO2逸出，這兩種模式屬可被認知的有機物質(zhì)礦化方式。方程式（2）是更準確的生物降解表達。

C聚合物轉(zhuǎn)化為C生物質(zhì)，然后C生物質(zhì)再以不同的動力學(xué)（b）轉(zhuǎn)化為CO2。嚴格地說，反應(yīng)（a）是生物降解，而反應(yīng)（b）是礦化。與化學(xué)反應(yīng)類似，可通過跟蹤反應(yīng)物的消耗或產(chǎn)物的出現(xiàn)來監(jiān)控生物降解過程。從技術(shù)角度來定量化監(jiān)控生物降解的最好方式是計量反應(yīng)物或是能量新陳代謝的終產(chǎn)物。

生物降解的百分數(shù)是放出的CO2與理論量CO2的比值。理論量CO2為投入反應(yīng)器塑料樣品中的元素碳全部氧化所應(yīng)生成的CO2量。

這一呼吸測量方法是借鑒經(jīng)濟合作與發(fā)展組織在20世紀80年代發(fā)布的關(guān)于化學(xué)品測試的指導(dǎo)書的內(nèi)容建立的。

1 材料和方法

1.1 材料

所用材料為聚葵二酸丁二醇酯（PBSe）——一種生物可降解性脂肪族聚酯。經(jīng)元素分析，其m（C）=65.43%，密度為1.12 g/cm3。以原有形態(tài)（小球）或經(jīng)液氮冷凍研磨和篩分后做土壤生物降解的試驗。得到的三部分顆粒尺寸范圍為：500～700 μm，200～355 μm，50～75 μm。

將微晶纖維素 ［m（C）=44.44%］粉末作參比物。

1.2 比表面測定

每一級粉末依顆粒測定比表面積（cm2/g），視顆粒為不等邊橢圓體，取20個顆粒以量規(guī)測定3個坐標軸的長短徑，用下式計算表面積：

式中 a，b和 c為半坐標軸，p為1.607 5（克努茲-湯姆森校正系數(shù)）。再由表面面積和20個顆粒的平均質(zhì)量計算比表面積（cm2/g）。

粉末的比表面積經(jīng)三種方法得出：（1） 理論方法計算；（2） 掃描電鏡圖像處理；（3）BET測定方法。

1.3 生物降解

生物降解依照 ASTM D5988—12標準方法測定，結(jié)果是基于所產(chǎn)生的CO2量。

聚葵二酸丁二醇酯的不同篩分是以微晶纖維素作參比物一起進行土壤降解。試驗數(shù)量為每個反應(yīng)器投1 g，也有一些篩分試驗量加倍（每個反應(yīng)器投2 g）。材料試驗中產(chǎn)生的CO2凈量，可通過從投入有聚合物的反應(yīng)器中產(chǎn)生的CO2量扣掉投入空白土壤的反應(yīng)器所產(chǎn)生CO2的平均量計算而得。生物降解的百分數(shù)，為試驗產(chǎn)生的CO2凈量與基于聚合物碳的CO2理論生成量之間的比值。

2 結(jié)果討論

2.1 粒子尺寸確定

將20個顆粒計量其尺寸和質(zhì)量，再由此來測定其平均比表面（cm2/g）。以理論方法估計不同篩分部分的表面積，將每一部分的粒子視為直徑等于每一級范圍極限中值的球體。見表1。

為了核實這一假設(shè)，曾進行圖像分析比照（結(jié)果差異均在觀測誤差范圍之內(nèi)）。另外，還進行BET分析，所測得結(jié)果比其他方法高3～5倍。

表1 由理論方法確定的比表面積

2.2 生物降解

各反應(yīng)器累計生成的CO2如圖1所示，對比試驗顯示的進程多數(shù)可重疊（相同征象，即圖中實線和虛線所示），只是總表面積分別是1 651 cm2和1 649 cm2的R11和R12在20～60 d之間出現(xiàn)分叉。圖1中各反應(yīng)器R1-R16的內(nèi)容物見表2。

圖1 不同反應(yīng)器R1-R16放出CO2的進程圖

圖2 展示了PBSe生物降解平均曲線，原有形態(tài)PBSe（表面積=33cm2的小球）的試驗結(jié)果是最慢的。當在138 d之后，所有曲線在80%高臺區(qū)均位于80%和90%范圍間，唯有33cm2小球例外地仍處在連續(xù)的生物降解中。

有關(guān)將生物降解視為塑料表面發(fā)生多相反應(yīng)的見解，為生物降解塑料領(lǐng)域工作的科學(xué)群體所創(chuàng)立。然而，閱讀已有文獻，發(fā)現(xiàn)少有文章系統(tǒng)化地論述表面對生物降解的影響，亦是以相同條件測試具有不同有效表面積的相同樣品。

將不同顆粒尺寸的可生物降解聚合物置于土壤中進行生物降解試驗，其不同尺寸的分級經(jīng)由研磨并篩分塑料顆粒而得，表面積的測定基于一種經(jīng)過顯微圖像分析驗證的理論方法。由另一實驗室做BET測定，該方法測得的表面積值比理論測定和圖像分析法要高3～5倍，因為BET是可以測定納米層級的多孔性。具有不同粒徑樣品的生物降解進程有時會有顯著差異。聚焦在生物降解的起始部分進行分析，當預(yù)料生物降解的速率是直接受聚合物礦化作用的影響，而不是受生成的生物質(zhì)的礦化影響，這個假設(shè)意指塑料粒子被一層會侵襲塑料的生物膜所包覆，通?？捎^察到漸進式的塑料件腐蝕與在樣品表面菌絲體的密集生長有關(guān)。反應(yīng)起始部分的生物降解曲線以線性回歸很好地進行表達。這意味著反應(yīng)速率遵循準零級動力學(xué)，即反應(yīng)速率為常數(shù)，不受物質(zhì)（聚合物）量所影響。很顯然，幾個月時間里反應(yīng)速率不變，也不受有效聚合物影響。為解釋這一恒定的速率，可認為生物降解速率受表面有效聚合物量的影響，而不受聚合物總量的影響。由恒定腐蝕所引起的表面變化與降解的起始階段不相關(guān)。

2.3 確定生物降解速率

每個篩分的剩余量C聚合物，通過在時間起點的C聚合物量減去放出的凈CO2的C量來確定。為了確定起始礦化速率k，從每一個樣品的第一生物降解階段C聚合物數(shù)據(jù)進行線性回歸分析（見圖3）。線性回歸分析的結(jié)果列于表3中，其斜率常數(shù)k即為礦化反應(yīng)速率（mg C聚合物/d），b 為截距常數(shù)，r2為試驗的相關(guān)系數(shù)。

礦化速率與表面積的關(guān)系采用回歸分析（簡單回歸）獲取，結(jié)果表明雙倒數(shù)模型最為適合（r2為98.7%）。雙倒數(shù)模型又稱為萊恩威弗伯克作圖法，用于米氏方程表達酶動力學(xué)。在圖4中，將聚合物起始總表面積的倒數(shù)（cm-2）與反應(yīng)速率的倒數(shù)（k-1）拿來做線性回歸，得到雙倒數(shù)作圖法的線性回歸方程如下式（其相關(guān)系數(shù)r2=0.987）。

y=11.557x+0.0103

y軸的截距為最大反應(yīng)速率的倒數(shù)(1/k最大)，如此則最大反應(yīng)速率為1/0.0103=97 mg/d。換句話說，在最佳條件下，反應(yīng)速率隨著有效面積的增加而上升直至到達最大值。

x軸的截距（即當y=0）為x=-0.0103/11.557=-0.0008912，其倒數(shù)值為1122 cm2。在酶動力學(xué)中，這就是米氏常數(shù)（Km），亦即反應(yīng)速率處在最大值一半時的物質(zhì)濃度。在此，Km代表反應(yīng)速率為最大值的一半時的表面積。如此，則表面積在1122 cm2時反應(yīng)速率是最大值的一半。

表2 生物降解試驗的內(nèi)容物

圖2 不同起始表面積PBSe的生物降解曲線

表3 線性回歸分析結(jié)果

圖3 生物降前期C聚合物隨時間減少及回歸線

圖4 反應(yīng)速率k與聚合物起始總表面積（cm2）雙倒數(shù)作圖

當不同樣品的起始降解速率分別與起始有效表面相關(guān)聯(lián)，雙倒數(shù)作圖法(即萊恩威弗伯克法)能很好地適應(yīng)數(shù)據(jù)。用雙倒數(shù)作圖法估量的最大速率為 97 mgC聚合物/d，這可認為是分子水平的降解速率，亦即該階段有效表面不限制降解（無限量的表面）。打個比方，如果1 g聚葵二酸丁二醇酯轉(zhuǎn)換為納米聚合物粒子，采取1 μm直徑球體的形式，則總表面積約為53 500 cm2，表面可容許 95 mgC聚合物/d的起始速率，假如整個生物降解過程保持恒定，這個速率容許在7 d內(nèi)達到90%生物降解門檻。顯然分子水平的生物降解速率是非?？斓?，聚葵二酸丁二醇酯納米聚合物亦可能滿足經(jīng)濟合作與發(fā)展組織所提出的“容易生物降解”條件。

以通常實驗室檢測方法測試得出的塑料生物降解速率拿來判別生物的降解性是為“表觀”速率。測試中發(fā)生在塑料表面的生物降解是很快的但是總的CO2逸出受到有效表面積限制，然而生物降解以逸出CO2與總碳（即Th CO2）的比值來計算，雖然多數(shù)碳不是“有效的”而是在塑料粒子的核心中包裹著，這樣CO2/Th CO2比值未能準確表達現(xiàn)實中發(fā)生的生物降解過程。塑料粒子顯現(xiàn)了很慢的生物降解結(jié)果，但是如果基于這個結(jié)果斷定聚葵二酸丁二醇酯的生物降解是慢的，則也不是準確表達出全速新陳代謝在分子層面所發(fā)生的境況。

從數(shù)據(jù)得出在未限定表面積的情況下，在設(shè)定條件下聚葵二酸丁二醇酯最大的生物降解速率為97 mg·C聚合物/d，（1 d 時間，97 mg聚合物碳礦化為CO2）。斷定特定的最大速率業(yè)已確定從而也意味著存在限制因素。我們相信限制因素是土壤中存在的活性微生物細胞的數(shù)量，而傾向于排除營養(yǎng)物缺乏這一因素，因為生物降解測試中所用的土壤添加了鹽，尤其是氮，磷和鉀。在酶的反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)了類似條件，在無限定物質(zhì)可用性情況下酶濃度作為反應(yīng)的限制因素。酶不像微生物會自身復(fù)制，因此微生物要應(yīng)對增加的有效面積，可我們關(guān)注的是起始部分的反應(yīng)，故對其生長的作用并不完全明了。我們期望同樣土壤（以及同樣環(huán)境條件）但不同的微生物量將顯示不同的最大生物降解速率，需要做進一步試驗來加以闡明。

意欲確證有效表面積對可生物降解聚合物的礦化速率的影響，以便從集中的CO2逸出速率判斷分子水平的礦化動力學(xué)。研究表明塑料生物降解速率的確定受技術(shù)上可實現(xiàn)的顆粒大小的影響。這樣判斷生物降解速率應(yīng)考慮計量CO2逸出速率受顆粒尺寸的影響，而未必說明這是一個快還是慢的反應(yīng)的證據(jù)。固有生物可降解性的測定應(yīng)基于一種方法對策，目的在于確定化學(xué)結(jié)構(gòu)是否對酶的攻擊敏感并最終轉(zhuǎn)化為礦物質(zhì)，盡可能減少偶然約束（如厚度、溫度、水活性等），為危險性評估的另一方面。

一般來說，在實驗室條件下給定最長的時間內(nèi)，一種塑料如能達到以礦化形式體現(xiàn)的最小的生物降解程度，便是生物可降解性合格的。這樣關(guān)于生物可降解塑料的標準描述為計量生物降解速率即定義了試驗方法并設(shè)置最小生物降解速率的要求。生物降解水平設(shè)為90%，涉及土壤的時間期限為幾個月甚至是幾年。如此，關(guān)于生物可降解性塑料的要求不同于經(jīng)濟合作與發(fā)展組織規(guī)定的必須在最長28 d內(nèi)證明生物降解的要求。似乎塑料的生物降解很緩慢，然而，此項工作表明在土壤中發(fā)生在分子水平的生物降解是很快的。

為了清楚起見，必須說明此項研究僅是聚焦在典型聚合物固有生物可降解性以及最大理論生物降解速率的評估上，所用的測試方法表明聚葵二酸丁二醇酯的最大生物降解速度很快，證明這種聚合物在化學(xué)上適合于生物降解。然而，以這種聚合物所做任何產(chǎn)品的物理性能將受厚度（亦即有效的表面積）以及環(huán)境條件（溫度、水活性、營養(yǎng)物可用性、微生物種群等）的影響。

3 結(jié)語

聚葵二酸丁二醇酯在土壤中的生物降解速率與有效的表面積相關(guān)聯(lián)，其功能運用雙倒數(shù)回歸模型進行表達，也就是通常應(yīng)用在酶動力學(xué)中測定米氏方程動力學(xué)參數(shù)的所謂萊恩威弗伯克作圖法。這就使得在非限定表面積的情況下，估計可達到的聚合物最大生物降解速率成為可能。據(jù)我們所知，這是首次對固體聚合物的最大生物降解速率的評估。

如果聚合物能以納米聚合物的方式測試，則很可能滿足經(jīng)濟合作與發(fā)展組織有關(guān)化學(xué)品“快速生物降解性”的標準。貼切地說，根據(jù)歐洲的“REACH”（化學(xué)品注冊、評估、許可和限制）規(guī)則，一旦物質(zhì)滿足“快速生物降解性”試驗要求，可假定其在生物活性環(huán)境中經(jīng)歷了快速而終極的降解?？梢姡诜肿铀缴系纳锝到庠u估，將可導(dǎo)致生物可降解塑料對環(huán)境作用較好的理解。

當所有可用的微生物以及酶器材全部參與到生物降解中，沒有更多物質(zhì)（指更多針對微生物的有效表面積）可被降解時，就達到最大生物降解速率。這一假設(shè)意味著通過改變開始試驗時存在的微生物數(shù)量，就可獲得不同的最大反應(yīng)速率的結(jié)果。需要進一步研究來支撐這一假設(shè)以及得出結(jié)論。