全基因組重測序研究長期鉻脅迫對希瓦氏菌MR-1的影響機(jī)制

肖長燁,肖 勇,趙 峰

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全基因組重測序研究長期鉻脅迫對希瓦氏菌MR-1的影響機(jī)制

肖長燁1,2,肖 勇1*,趙 峰1

(1.中國科學(xué)院城市環(huán)境研究所,城市污染物轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 廈門 361021；2.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

在實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)條件下,設(shè)計了希瓦氏菌MR-1在恒定濃度Cr(VI)和Cr(III)環(huán)境中長期脅迫120d實(shí)驗(yàn),探討了脅迫后的菌株對Cr(VI)的還原能力和生長情況,采用電化學(xué)分析儀表征其電化學(xué)性質(zhì)的變化,并且利用全基因組重測序技術(shù)分析了不同條件脅迫后不同階段的菌株基因變異信息.結(jié)果表明,Cr(VI)長期脅迫下明顯提高了菌株對Cr(VI)的耐受性和還原能力,在38h左右能完全還原初始Cr(VI)濃度55mg/L;在電位-0.2V還原峰附近,細(xì)胞色素與核黃素的結(jié)合作用有明顯差異;通過重測序結(jié)果發(fā)現(xiàn), Cr(VI)長期脅迫下的菌株發(fā)生突變的基因點(diǎn)位明顯高于Cr(III)環(huán)境.Cr(III)環(huán)境脅迫下的非同義突變基因主要集中在葡萄糖轉(zhuǎn)化及合成相關(guān)功能的基因、編碼呼吸鏈酶和合成ATP酶的相關(guān)基因、編碼信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因,Cr(VI)環(huán)境脅迫120d后,主要涉及細(xì)胞膜組分基因,轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因,DNA合成、修復(fù)相關(guān)基因和氧化還原活性相關(guān).

長期脅迫；還原能力；電化學(xué)性質(zhì)；全基因組重測序

工業(yè)化進(jìn)程的加快導(dǎo)致重金屬污染問題日益嚴(yán)重,鉻(Cr)是一種重金屬過渡元素,通常以鉻酸鹽和重鉻酸鹽的形式存在廢水中,廣泛應(yīng)用于電鍍、皮革鞣制、水泥、印染以及鋼鐵制造業(yè)[1].鉻主要以六價和三價的形態(tài)存在,六價鉻Cr(VI)能通過細(xì)胞膜的硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)通道進(jìn)入細(xì)胞,破壞DNA結(jié)構(gòu),改變生物的遺傳性狀,對人體具有極高的毒性和致突變作用[2].與Cr(VI) 相比,三價鉻Cr(III)無法被有效運(yùn)輸?shù)酱蠖鄶?shù)細(xì)胞內(nèi),而是形成氫氧化物或磷酸鹽沉淀物,許多水處理系統(tǒng)中Cr(III)通常以中性的pH沉淀固定[3].對人體而言,Cr(III)是相對毒性較低的污染物,但是對于魚類,其毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Cr(VI)[4].

近年來測序技術(shù)的不斷提升更新,二代測序已經(jīng)非常成熟,全基因組重測序基于二代測序平臺對進(jìn)化物種的基因組序列進(jìn)行全面檢測[5],通過比較參考基因組序列差異,找到大量的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP,),插入或缺失位點(diǎn)(InDel),結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn)(SV)和拷貝數(shù)變異位點(diǎn)(CNV),從而總結(jié)生物體在長期污染物脅迫下的適應(yīng)性機(jī)制.目前關(guān)于微生物在污染環(huán)境中的長期適應(yīng)性機(jī)理研究比較缺乏.微生物修復(fù)技術(shù)[6]就是利用人工馴化好的具有特定功能的微生物降低環(huán)境中的污染物毒害作用,特定功能的微生物馴化過程就是一個長期脅迫下的適應(yīng)結(jié)果,而目前的研究很少結(jié)合全基因組重測序手段研究Cr的長期脅迫對微生物的影響,深入挖掘微生物在Cr長期脅迫下的適應(yīng)機(jī)制對理解微生物修復(fù)技術(shù)的過程具有重要意義.

因此,本研究選取具有電化學(xué)活性的希瓦氏菌MR-1為對象,利用含重金屬K2CrO4和CrCl3溶液的培養(yǎng)基模擬鉻污染環(huán)境,通過脅迫微生物120d,分析比較在重金屬Cr(VI)和Cr(III)環(huán)境下長期脅迫后的表型和基因型差異,總結(jié)其適應(yīng)性進(jìn)化過程的特性和關(guān)鍵功能基因,通過對非同義突變基因進(jìn)行GO富集分析,闡述變異基因涉及的功能類目差異,以期為微生物長期處于不同形態(tài)鉻的毒性機(jī)理和抗性機(jī)制提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株及其培養(yǎng)條件

本實(shí)驗(yàn)使用的微生物為中國科學(xué)院城市污染物轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室存放-80℃冰箱中的希瓦氏菌MR-1.該菌株通過在LB瓊脂培養(yǎng)基上活化,而后接種至液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)作為原代菌株,恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件控制在30℃,150r/min.

1.2 長期脅迫實(shí)驗(yàn)

從原始菌株分別繁殖6個群體,其中3個群體在恒定濃度Cr(VI)下長期脅迫(樣品標(biāo)記為DXCr6,其中X為培養(yǎng)d數(shù)),另外3個群體為恒定濃度Cr(III)下長期脅迫(樣品標(biāo)記為DXCr3,其中X為培養(yǎng)d數(shù)).所有群體都在恒溫?fù)u床中孵化培養(yǎng),條件嚴(yán)格控制30℃,150r/min.每個平行樣品每隔48h進(jìn)行轉(zhuǎn)接1次,分別吸取菌株0.5mL接種至含49.5mL的LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行脅迫生長(即接種比例1:100),波長600nm的初始吸光度控制在(0.06±0.005).

每瓶培養(yǎng)基添加適量的K2CrO4或CrCl3溶液配制成含55mg/L Cr的重金屬培養(yǎng)基.所有操作均在超凈工作臺中進(jìn)行,每瓶樣品確保無交叉污染,并且每隔10d左右將脅迫后的菌種用20%的甘油進(jìn)行1:1混合保存于-80℃冰箱中.

1.3 生長曲線和Cr(VI)還原能力測定

采用紫外分光光度計,菌株在含Cr(VI)的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至不同時間點(diǎn)進(jìn)行采樣,在吸光度600nm處測得生長曲線.樣品經(jīng)離心后的上清液Cr(VI)含量采用二苯碳酰二肼分光光度法[7],波長為540nm,,其中設(shè)置未接入菌種原的重金屬LB培養(yǎng)基作為陰性對照.

1.4 循環(huán)伏安曲線和差分脈沖伏安曲線掃描

分別選取經(jīng)Cr(VI)和Cr(III)長期脅迫120d后的菌株作為電化學(xué)掃描研究對象.將脅迫菌株D120Cr3、D120Cr6和原始菌株MR-1培養(yǎng)至指數(shù)生長期中期,6500r/min,4℃條件下離心10min,搜集沉淀的菌體,用100mM PBS緩沖液進(jìn)行洗滌,去除殘余的LB培養(yǎng)基干擾組分.實(shí)驗(yàn)采用三電極體系,工作電極為直徑3mm的玻碳電極,參比電極為Ag/AgCl電極,對電極為碳棒,電化學(xué)測試平臺為上海辰華CHI660D.

1.5 全基因組測序及生物信息分析

重測序樣品分別選取Cr(III)長期脅迫60d(D60Cr3)、80d(D80Cr3)和120d(D120Cr3)的樣品,Cr(VI)長期脅迫80d(D80Cr6)和120d(D120Cr6)的樣品進(jìn)行DNA提取及測序,每個樣品有3個平行樣,一共15個脅迫菌株.DNA提取試劑盒為Wizard? Genomic DNA Purifcation Kit,提取詳細(xì)步驟按官方說明書,雙端測序平臺為Illumina Hiseq 4000.

全基因組測序返回的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息分析,步驟如下:首先利用FastQC軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制分析,統(tǒng)計每條測序數(shù)據(jù)的reads大小、GC的含量、Q20和Q30的百分比,確保數(shù)據(jù)可用;利用比對軟件BWA-mem(mem采用最新的比對算法)將過濾后的數(shù)據(jù)與參考基因組進(jìn)行比對,將比對后的文件利用samtools軟件進(jìn)行計算平均測序深度和覆蓋度;利用GATK和Samtools軟件結(jié)合進(jìn)行變異位點(diǎn)的檢測過濾得到可信的變異位點(diǎn);最后用Snpeff軟件對變異位進(jìn)行信息注釋統(tǒng)計.

2 結(jié)果與分析

2.1 長期脅迫后對Cr(VI)的還原能力分析

經(jīng)過恒定Cr(III)長期脅迫下的菌株,無論是80d(趨勢與圖1類似)還是120d(圖1)對Cr(VI)的還原效率提升效果并不明顯,并且對Cr(VI)的耐受性也沒有很明顯的提高,這說明長期暴露在Cr(III)環(huán)境下并不能完全激發(fā)菌體MR-1對Cr(VI)抗性,同時也無法激活分泌較多的功能酶參與Cr(VI)的還原過程.從圖2可以明顯觀察到在Cr(VI)的長期脅迫下,菌株已經(jīng)完全具備對當(dāng)前55mg/L Cr(VI)濃度的耐受性,能很好生長,并且在38h左右將其完全還原.隨著脅迫時間的增加,我們發(fā)現(xiàn)菌株在80~120d Cr(VI)持續(xù)脅迫中對Cr(VI)的還原效率并沒有提升,這也說明細(xì)菌對重金屬Cr(VI)的還原能力早已達(dá)到最大值,后期的持續(xù)脅迫并沒有帶來還原效率的提升,因此,想要獲得具有高還原能力的進(jìn)化菌株必須逐步增加重金屬的濃度,使其不斷提升抗性從而獲得更好的還原效果.

圖1 希瓦氏菌MR-1經(jīng)Cr(III)脅迫120d后的生長和Cr(VI)還原情況 Fig.1 Growth and Cr(VI) reduction of Shewanella oneidensis MR-1after 120-day cultivation in Cr(III)

圖2 希瓦氏菌MR-1經(jīng)Cr(VI)脅迫120d后的生長和Cr(VI)還原情況 Fig.2 Growth and Cr(VI) reduction of Shewanella oneidensis MR-1after 120-day cultivation in Cr(VI)

2.2 電化學(xué)活性分析

希瓦氏菌MR-1是一株電化學(xué)活性菌,菌體的電子傳遞能力在細(xì)胞代謝和污染物降解過程中具有重要作用,因此很有必要了解其在鉻脅迫后的電化學(xué)性質(zhì)變化情況.如圖3所示經(jīng)過Cr(III)和Cr(VI)長期脅迫120d的希瓦氏菌MR-1菌體仍然存在特有的氧化還原活性物質(zhì)[8].在+0.1V附近有明顯的氧化峰,已有研究通過基因和蛋白組學(xué)證明其是由菌體表面細(xì)胞色素引起的氧化響應(yīng)[9],作為直接電子傳遞途徑.核黃素能夠被大多數(shù)的生物合成,具有非常重要的生理代謝功能,MR-1能夠分泌核黃素作為電子中介體與電極進(jìn)行間接電子傳遞[10],在-0.4V附近有一對氧化還原峰則為核黃素物質(zhì)的峰位置.在經(jīng)過長期暴露后的MR-1在細(xì)胞色素和核黃素相應(yīng)的氧化還原位置仍然具有顯著的電化學(xué)活性.

如圖3(C)所示在-0.2V位置相應(yīng)的還原峰有明顯偏差,經(jīng)過Cr(III)長期脅迫的菌株在此處位置的峰面積要明顯小于Cr(VI)脅迫后的菌體, Okamoto 等[11]發(fā)現(xiàn)在-0.2V位置的峰主要是由于細(xì)胞色素能和核黃素類物質(zhì)進(jìn)行結(jié)合增強(qiáng)其電子傳遞能力.因此,推測MR-1在Cr(III)長期脅迫下,Cr(III)在一定程度上會影響細(xì)胞色素與核黃素的結(jié)合作用,減弱二者的結(jié)合從而減弱其電子傳遞能力.

2.3 長期鉻脅迫的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)數(shù)量

圖4 不同脅迫階段的單核苷酸變異數(shù)量 Fig.4 Numbers of single nucleotide mutations at different stress stages

對恒定濃度Cr(III)脅迫60d(D60Cr3_1 D60Cr3_2D60Cr3_3),80d(D80Cr3_1D80Cr3_2D80Cr3_3),120d(D120Cr3_1D120Cr3_2D120Cr3_3)的9個樣品以及Cr(VI)脅迫80d和120d的6個樣品進(jìn)行全基因組重測序,參考基因組是在NCBI網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫獲得.所有的脅迫菌株通過與原始菌株比較后,能夠得到可信度較高的突變位點(diǎn).圖4可以看到恒定濃度Cr(III)脅迫后的菌株突變個數(shù)隨著時間并沒有明顯的增加,維持在相對恒定的SNP數(shù)量,與Cr(VI)的脅迫菌株相比明顯要少.這可能與兩者脅迫環(huán)境的毒性有關(guān),Cr(III)的環(huán)境相對比較穩(wěn)定,并不會引發(fā)菌體發(fā)生較大的突變;而Cr(VI)的毒性相對較高,容易破壞菌體的穩(wěn)定性,細(xì)胞需要發(fā)生特定的適應(yīng)性突變提高自身的耐受性,因此,單核苷酸變異的位點(diǎn)相對較多.

2.4 在Cr(III)脅迫后非同義突變位點(diǎn)分析

在外界環(huán)境脅迫下,微生物感知環(huán)境條件的變化并正確作出反應(yīng)的能力對其生存至關(guān)重要,而長期處于環(huán)境脅迫下的微生物會使相關(guān)的功能基因發(fā)生正向改變,從而更好適應(yīng)環(huán)境壓力.非同義突變能夠改變氨基酸的種類,在一定程度上成為適應(yīng)性增強(qiáng)的主要因素.

由表1可知,在適應(yīng)Cr(III)環(huán)境整個過程中,微生物涉及許多與葡萄糖轉(zhuǎn)化及合成相關(guān)功能的基因變異,從而增強(qiáng)自身對營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化能力使其穩(wěn)定生長,包括基因、SO_3185、和調(diào)控葡萄糖合成和葡糖基轉(zhuǎn)移酶以控制細(xì)胞的生長速率和生長活性[12-14],、和控制細(xì)胞分裂的速率,在一定程度上與其生長速率密切相關(guān)[15],以上涉及的功能成為微生物適應(yīng)外界Cr(III)脅迫環(huán)境的主要途徑.

表1 Cr(III)脅迫120d后的非同義突變點(diǎn)位 Table 1 Nonsynonymous mutant sites after 120-day cultivation in Cr(III) environment

續(xù)表1

菌株基因堿基替換基因功能 D80Cr3_2rpsGA > G30S ribosomal protein crpC > TcAMP-responsive regulator of catabolite repression D80Cr3_3glgAC > Tglycogen synthase ADP-glucose transglucosylase SO_3185C > Tenzyme for biosynthesis of dTDP-Qui4N yceIG > AUPF0312family alkali-inducible periplasmic protein mexET > CHAE1family efflux pump MFP component ndhA > Grespiratory NADH dehydrogenase II wcvBT > AUDP-glucose dehydrogenase D120Cr3_1secYG > Apreprotein translocase subunit aceEC > Tpyruvate dehydrogenase E1component SO_0456G > Talpha-ketoglutarate uptake system substrate-binding component SO_1967C > Tpredicted membrane protein SO_3185C > Tenzyme for biosynthesis of dTDP-Qui4N sufSG > Acysteine desulfurase ttrSC > Tthiosulfate/tetrathionate-responsive two component signal transduction system histidine kinase ppaCC > Tinorganic pyrophosphatase manganese-dependent murCT > AUDP-N-acetylmuramate--alanine ligase D120Cr3_2rpsGA > G30S ribosomal protein crpC > TcAMP-responsive regulator of catabolite repression azuC > Tperiplasmic azurin SO_0881T > Cpredicted TAT leader-containing periplasmic protein D120Cr3_3rpsGA > G30S ribosomal protein crpC > TcAMP-responsive regulator of catabolite repression azuC > Tperiplasmic azurin SO_0881T > Cpredicted TAT leader-containing periplasmic protein

與編碼呼吸鏈酶和合成ATP酶的相關(guān)基因.基因編碼泛醌氧化還原酶,促進(jìn)從NADH到泛素的電子轉(zhuǎn)移,并將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上,產(chǎn)生膜電位和質(zhì)子梯度,用于ATP的合成[16].是一種重要的熱休克必要基因,影響著ATP酶合成速率,是某些條件下細(xì)菌存活所必需的[17].同時,和基因同樣調(diào)節(jié)著ATP酶的活性,控制著MR-1的新陳代謝活性,使其快速適應(yīng)環(huán)境壓力的變化.

編碼信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因.有研究發(fā)現(xiàn)和蛋白復(fù)合體構(gòu)成了Na離子通道,并且驅(qū)動極性鞭毛的運(yùn)動,遠(yuǎn)離周邊環(huán)境有害物質(zhì)[18].大部分細(xì)菌都具有Sec通道,其中內(nèi)膜蛋白SecY和SecE是此通道的核心,基因調(diào)控膜內(nèi)外營養(yǎng)物質(zhì)的穩(wěn)定,對維持細(xì)胞內(nèi)代謝穩(wěn)定具有十分重要的作用[19].跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白涉及的基因變異還包括、、SO_1967和SO_0881,說明細(xì)胞需要增強(qiáng)跨膜運(yùn)輸?shù)哪芰?提高新陳代謝能力的同時減少胞內(nèi)污染物的累積.微生物在受到外界刺激的同時需要信號分子傳遞信息,持續(xù)檢測環(huán)境的變化,引發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列生物化學(xué)反應(yīng)和蛋白相互作用,信號轉(zhuǎn)導(dǎo)控制著整個生命過程的分化,增殖和代謝等方面的表達(dá)和調(diào)控,實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果涉及非同義突變點(diǎn)位包括、S和基因的變異,進(jìn)一步證實(shí)MR-1在適應(yīng)過程中的調(diào)控機(jī)制過程.

綜上,MR-1在脅迫60d的時間主要涉及調(diào)控微生物對營養(yǎng)底物的利用和ATP酶活性相關(guān)的基因,隨著脅迫時間延長,MR-1的變異更多集中在其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能和跨膜運(yùn)輸功能的基因,并且有個別基因涉及到耐受性的提高和細(xì)胞膜上外排功能的通道基因等.已有研究證明對細(xì)胞提高環(huán)境壓力的耐受性具有很重要的作用,編碼與外排系統(tǒng)相關(guān)的功能蛋白對細(xì)胞耐受性提高也是具有促進(jìn)作用,能夠調(diào)控電子轉(zhuǎn)移到細(xì)胞色素上的氧化酶,對污染物的還原具有促進(jìn)作用.

2.5 恒定Cr(VI)環(huán)境脅迫下的變異基因富集分析

從圖5可以看出Cr(VI)環(huán)境脅迫下變異基因涉及多種生物學(xué)過程,其中80d脅迫下的基因功能主要涉及蛋白酶解過程(參與蛋白質(zhì)代謝過程)、DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程(調(diào)節(jié)細(xì)胞DNA模板化的轉(zhuǎn)錄頻率、速率)、蛋白分泌過程(受控蛋白的釋放)、嗜同性細(xì)胞粘附過程、發(fā)病機(jī)制相關(guān)過程(一組特定的過程,產(chǎn)生一種有機(jī)體引起另一有機(jī)體異常的、通常是有害的狀態(tài)的能力)和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程;120d脅迫后在生物學(xué)過程主要涉及運(yùn)輸過程(某些物質(zhì)或細(xì)胞成分在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間的定向運(yùn)動)、跨膜運(yùn)輸過程(膜內(nèi)外的物質(zhì)運(yùn)輸)、翻譯過程、蛋白酶解過程、代謝過程、蛋白分泌過程、DNA的復(fù)制、重組和修復(fù)過程、依賴?yán)w毛或鞭毛的細(xì)胞運(yùn)動過程.

在細(xì)胞組分層面中,80d脅迫下基因功能主要涉及在細(xì)胞膜和質(zhì)膜的有機(jī)組分、外膜組分、細(xì)胞質(zhì)組分和細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)組分;而在120d脅迫下細(xì)胞組分層面受影響較大的同樣集中在細(xì)胞膜和質(zhì)膜的有機(jī)組分、細(xì)胞質(zhì)組分、細(xì)胞內(nèi)組分、細(xì)胞外膜組分和運(yùn)動纖毛.

在分子功能層面上,80d的脅迫過程主要涉及ATP的結(jié)合功能(機(jī)體活性的能量來源)、代謝功能(包括合成代謝和分解代謝)、金屬離子的合成功能(有選擇地與任何金屬離子進(jìn)行非共價的相互作用)、DNA結(jié)合功能(基因產(chǎn)物與DNA相互作用的分子功能)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性(使蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)外定向移動)和水解酶活性;而120d下的變異基因更多涉及到了ATP的結(jié)合功能、轉(zhuǎn)運(yùn)體活性(使大分子、小分子、離子物質(zhì)定向運(yùn)動進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞之間)、氧化還原酶活性、催化活性、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、鎂離子結(jié)合功能(涉及焦磷酸酶的合成,是重要的產(chǎn)能過程)和DNA結(jié)合相關(guān)功能等.

綜合以上結(jié)果分析,在恒定Cr(VI)濃度下持續(xù)脅迫過程中,變異基因主要富集的功能在不同時間段有所異同,其中120d的脅迫過程所涉及的基因功能基本都涵蓋了80d脅迫下的基因功能,不同的是在脅迫時間的增加下,120d所涉及的變異基因數(shù)量更多,并且其富集的功能目錄更多.

圖5 Cr(VI)持續(xù)脅迫120d后變異基因GO富集分析

3 結(jié)論

3.1 希瓦氏菌MR-1在Cr(VI)環(huán)境持續(xù)脅迫120d后,明顯提升了對Cr(VI)的耐受性,并提高其對Cr(VI)的還原能力,而Cr(III) 環(huán)境持續(xù)脅迫120d后并不能顯著提高對Cr(VI)的耐受性.

3.2 電化學(xué)活性的差異體現(xiàn)在峰電位-0.2V處細(xì)胞色素與核黃素類物質(zhì)結(jié)合體,與菌株胞外電子傳遞能力相關(guān),Cr(VI)長期脅迫相比Cr(III)脅迫后的進(jìn)化菌株在此位置有明顯增強(qiáng),說明希瓦氏菌MR-1對Cr(VI)抗性及還原能力的提升與細(xì)胞色素結(jié)合核黃素類物質(zhì)有一定相關(guān)性.

3.3 通過基因功能分析發(fā)現(xiàn)Cr(III)環(huán)境脅迫下的突變菌株主要發(fā)生在葡萄糖轉(zhuǎn)化及合成相關(guān)功能的基因、編碼呼吸鏈酶和合成ATP酶的相關(guān)基因、編碼信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因.Cr(VI)環(huán)境脅迫120d后,非同義突變基因的功能主要涉及細(xì)胞膜組分基因,轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因,DNA合成、修復(fù)相關(guān)基因和氧化還原活性相關(guān).

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Mechanism of long-term chromium stress onMR-1using whole genome resequencing technique.

XIAO Chang-ye1,2, XIAO Yong1*, ZHAO Feng1

(1.Key Laboratory of Urban Pollutant Conversion, Institute of Urban Environment, Chinese Acaderny of Sciences, Xiamen 361021, China；2.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)., 2019,39(3)：1261~1267

The 120-day long-term stress of constant concentration of Cr(VI) and Cr(III) onMR-1 was investigated in the present study. The reduction ability of Cr(VI) and growth were explored after the 120-day cultivation. The electrochemical properties were characterized, and the genetic variation of strains at different stages was analysed using whole genome resequencing technology. The results showed that the long-term stress of Cr(VI) significantly improved the tolerance and reducing ability of Cr(VI). The initial Cr(VI) concentration of 55mg/L was completely reduced within 38h after the 120-day cultivation. There was a significant difference in the binding of cytochrometo riboflavin near the -0.2V reduction peak between the strains cultured in media with Cr(VI) and Cr(III). The mutation gene numbers of strains under long-term Cr(VI) stress were significantly higher than that in Cr(III) environment. Non-synonymous mutated genes in strains under Cr(III) stress mainly involved in glucose transformation and synthesis, genes encoding respiratory chain enzymes and synthetic ATPase, genes encoding signal transduction and transmembrane transporters. After the 120-day of Cr (VI) stress, mutated genes in strains mainly involved with cell membrane component genes, transporters, signal transduction genes, DNA synthesis repair genes and redox activity.

long-term stress；reducing ability；electrochemical properties；whole genome resequencing

X172

A

1000-6923(2019)03-1261-07

肖長燁(1991-),男,福建大田人,碩士,主要從事環(huán)境微生物學(xué)研究.發(fā)表論文1篇.

2018-08-14

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(51878640,51478451);中國科學(xué)院青年創(chuàng)新促進(jìn)會(2018344)

* 責(zé)任作者, 副研究員, yxiao@iue.ac.cn