硫酸慶大霉素片的質(zhì)量評價

姚永青 梅芊 王立萍 郜繼東 李少杰 劉英

(河南省食品藥品檢驗所，鄭州 450018)

慶大霉素為美國Schering公司W(wǎng)einstein等于1963年發(fā)現(xiàn)[1]，1966年其硫酸鹽應用于臨床，1965年我國中科院福建微生物研究所分離得到產(chǎn)生菌，1969年經(jīng)研制成功后并投入生產(chǎn)[2]。硫酸慶大霉素是一種殺菌力較強的廣譜抗生素，抗菌譜廣、抗菌作用強，其抗菌作用機理為與細菌核糖體30S亞單位結合，抑制細菌蛋白質(zhì)的合成，妨礙初始復合物的合成，從而導致細菌死亡[3]，常見毒副作用為耳、腎毒性。慶大霉素為發(fā)酵產(chǎn)生的多組分氨基糖苷類抗生素，臨床上使用的慶大霉素主要由C1、C1a、C2和C2a4個活性成分組成，另外還有多種微量次要組分，各組分的毒性與抗菌能力有一定的差異，因此復合物中各組分比例與有關物質(zhì)含量的變化關系著產(chǎn)品的療效與毒副作用，并且影響到產(chǎn)品的質(zhì)量[4]。

硫酸慶大霉素口服基本不吸收，在腸道中能達高濃度，臨床適用于腸道感染與結腸手術前準備[5]。檢索河南省食品藥品評價中心數(shù)據(jù)庫，近5年不良反應主要有惡心、嘔吐與食欲異常等，無嚴重不良反應。

中國藥典2015年版(ChP2015)[6]收載原料、注射劑、片劑與顆粒劑，美國藥典(USP40)[7]與英國藥典2017(BP2017)[8]收載原料、注射劑與滴眼劑等，歐洲藥典(EP9.0)[9]收載原料，日本藥典(JP17)[10]收載原料與滴眼劑，國外藥典均未收載片劑。

硫酸慶大霉素片被列入2017年度國家藥品質(zhì)量評價抽驗計劃，有20mg(2萬單位)與40mg(4萬單位)2個規(guī)格，本次抽驗涉及40mg(4萬單位)1個規(guī)格。本研究在完成法定標準檢驗的基礎上，圍繞藥品的有效性、安全性與標準的可控性，從穩(wěn)定性、有關物質(zhì)、慶大霉素C組分與溶出行為等方面進行探索性研究，依據(jù)法定檢驗與探索性研究實驗結果，對國內(nèi)市場上硫酸慶大霉素片的產(chǎn)品質(zhì)量進行分析，并為進一步完善質(zhì)量標準提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑

Waters2695高效液相色譜儀(Alltech 2000ES蒸發(fā)光散射檢測器，Empower色譜工作站)，RCZ-8M溶出試驗儀(天津市天大科技有限公司)，Lambda 35紫外可見分光光度計(美國PE公司)，ZB-1D智能崩解儀器(重慶雅馬拓科技有限公司)，BD240孵卵箱(德國BINDER公司)，ZY-300IV多功能微生物自動測量儀(北京先驅(qū)威鋒技術開發(fā)公司)，YB-2型澄明度檢測儀(天大天發(fā)科技有限公司)，XPE205電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。

三氟乙酸為色譜純(Dikma公司)，甲醇為色譜純(Merck公司)，氮氣為高純氮；其余試劑均為分析純，水為MillQ去離子水。

1.2 樣品

慶大霉素標準品(批號：130326-201015，含量C114.7%，C1a15.3%，C2a8.5%，C218.5%；630u/mg)，小諾霉素標準品(批號：130342-201404，含量51.8%)，西索米星對照品(批號：130635-201301，含量56.0%)，均由中國食品藥品檢定研究院提供。

156批次硫酸慶大霉素片均為2017年國家藥品計劃抽驗樣品，包括糖衣片117批次(來自8家生產(chǎn)企業(yè))、薄膜衣片27批次(來自1家生產(chǎn)企業(yè))、素片12批次(來自2家生產(chǎn)企業(yè))。影響因素試驗樣品：硫酸慶大霉素片(批號：2170528，規(guī)格40mg，糖衣片，A企業(yè))，硫酸慶大霉素片(批號：1705171，規(guī)格40mg，薄膜衣片，I企業(yè))

2 試驗方法

2.1 法定標準檢驗

法定標準為ChP2010年版二部[11]、ChP2015年版二部[6]與國家藥品監(jiān)督管理局藥品補充申請批件(批件號：2002HFB0226)。ChP2010年版二部與ChP2015年版二部質(zhì)量標準項目設置與限度均相同，注冊標準為薄膜衣片，其項目設置與限度與ChP2015年版二部相同。

2.2 探索性研究

參照ChP2015年版二部硫酸慶大霉素質(zhì)量標準[6]建立片劑有關物質(zhì)與慶大霉素C組分測定方法，并對156批次樣品進行考察；參照ChP2015年版二部硫酸慶大霉素緩釋片[6]質(zhì)量標準建立片劑溶出度測定方法，并對不同企業(yè)與不同批次的樣品進行溶出度考察。

2.2.1 有關物質(zhì)

色譜柱：GRACE Apollo C18(4.6mm×250mm,5μm)；流動相：0.2mol/L三氟乙酸溶液-甲醇(96:4)，110℃，載氣(氮氣)流量2.8L/min，柱溫35℃，供試品溶液濃度1.0mg/mL，進樣量50μL。擬定標準限度為：含西索米星不得過標示量的2.0%，小諾霉素不得過標示量的3.0%。除硫酸峰、亞硫酸峰和糊精峰等輔料峰外，其他雜質(zhì)峰按西索米星雙對數(shù)線性回歸方程計算，其他單個雜質(zhì)不得過標示量的2.0%，其他雜質(zhì)總量不得過標示量的4.5%。

2.2.2 慶大霉素C組分

色譜柱：GRACE Apollo C18(4.6mm×250mm,5μm)；流動相：0.2mol/L三氟乙酸溶液-甲醇(96:4，V/V)，流速0.6mL/min，蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度110℃，載氣(氮氣)流量2.8L/min，柱溫35℃，供試品溶液濃度1.0mg/mL，進樣量25μL。擬定標準限度為：C1應為標示量的15.3%～28.0%，C1a應為標示量的19.6%～48.0%，C2a+C2應為標示量的28.5%～63.8%，4個組分總含量不得低于標示量的90%。

2.2.3 穩(wěn)定性

制劑生產(chǎn)工藝的影響：采用新建方法對調(diào)研所得原料與其對應制劑的有關物質(zhì)與組分進行測定。

影響因素試驗[12]：取影響因素試驗樣品分別置于60℃恒溫培養(yǎng)箱中(高溫試驗)；置于底部放置KNO3飽和溶液的干燥器中，放入25℃恒溫培養(yǎng)箱(高濕試驗)；置于光照度4500Lx下(強光照射試驗)。各放置條件的樣品均于5d與10d取樣。

2.2.4 溶出行為

溶出曲線溶出條件：漿法，50r/min，溶出介質(zhì)為pH1.2鹽酸溶液、pH4.0醋酸鹽緩沖液、pH6.8磷酸鹽緩沖液與水共4種，溶出介質(zhì)體積900mL，薄膜衣片與素片分別于15與30min取樣，糖衣片分別于10、20、30、45、60與75min取樣。

測定方法：取續(xù)濾液與0.04mg/mL對照溶液各3mL于具塞試管中，加異丙醇2.2mL，鄰苯二醛試液0.8mL，密塞，搖勻，置于60℃水浴中加熱15min，冷卻至室溫，照紫外-可見分光光度法，在300～400nm的波長范圍內(nèi)掃描一階導數(shù)光譜圖，在350～360nm的波長最大峰谷處分別測定吸光度。

3 試驗結果

3.1 法定標準檢驗結果

按法定標準檢驗，156批次片劑均符合規(guī)定，合格率100%。結果見表1。

3.1.1 崩解時限

由表1可知，117批次糖衣片的完全崩解時間為9～36min，27批次薄膜衣片的完全崩解時間為9～19min，12批次素片的完全崩解時間為5～6min，均在規(guī)定時間內(nèi)完全崩解。但不同企業(yè)糖衣片崩解時間差異較大，崩解較快的A企業(yè)為9～14min；崩解較慢的H企業(yè)為23～36min，分析與企業(yè)的制劑生產(chǎn)工藝有關。

3.1.2 含量測定

法定標準為抗生素微生物檢定法，156批次樣品含量為91.8%～107.8%，均符合規(guī)定。其中A企業(yè)與C企業(yè)含量結果RSD值均較大，分析與批間原料差異以及制劑生產(chǎn)工藝有關。

3.1.3 小結

慶大霉素為發(fā)酵產(chǎn)生的氨基糖苷類抗生素，除C1、C1a、C2和C2a4種主要組分外，還有多種微量組分，各組分的毒性與抗菌能力有一定的差異?，F(xiàn)行標準設置較簡單，僅采用效價法檢測制劑的含量，而效價法是對制劑綜合活性的檢測，未對主要組分與有關物質(zhì)進行控制，存在藥物使用的有效性與安全性風險，現(xiàn)行質(zhì)量標準存在不能有效控制藥品質(zhì)量的風險。

表1 硫酸慶大霉素片法定標準檢驗結果Tab.1 Legal standard test results of gentamicin sulfate tablets

3.2 探索性研究結果

根據(jù)現(xiàn)行標準檢驗結果與對該制劑的綜合分析，從穩(wěn)定性、有關物質(zhì)、慶大霉素C組分與溶出行為4方面進行探索性研究。

3.2.1 片劑穩(wěn)定性

采用新建方法對從企業(yè)調(diào)研所得原料與其對應制劑的有關物質(zhì)進行檢測考察制劑生產(chǎn)工藝的影響。結果顯示原料與其對應制劑的有關物質(zhì)含量基本一致，表明硫酸慶大霉素性質(zhì)穩(wěn)定，制劑生產(chǎn)過程中不再產(chǎn)生新的雜質(zhì)，雜質(zhì)含量也不再增加。表明制劑生產(chǎn)工藝對有關物質(zhì)無影響。結果見表2。

影響因素試驗對影響因素實驗樣品的性狀、崩解時限、慶大霉素C組分、有關物質(zhì)與含量進行考察。結果見表3。

由表3可知，高溫試驗5d與10d，糖衣片與薄膜衣片除去包衣后顏色均加深，有關物質(zhì)、慶大霉素C組分、崩解時限與含量均基本無變化；高濕試驗與強光照射試驗后，糖衣片與薄膜衣片的各考察項均基本無變化。分析糖衣片與薄膜衣片高溫試驗后除去包衣顏色加深的原因是片劑中的輔料如淀粉和蔗糖等高溫后顏色加深導致，但有關物質(zhì)、慶大霉素C組分與含量均基本無變化，表明其主要活性成分與有關物質(zhì)均未發(fā)生變化，高溫對藥品質(zhì)量無影響。因此硫酸慶大霉素片對高溫、高濕度與強光照射穩(wěn)定。

3.2.2 有關物質(zhì)

采用新建方法對156批次樣品進行檢測，結果148批次樣品符合原料有關物質(zhì)標準的規(guī)定，8批次樣品不符合規(guī)定。有關物質(zhì)典型色譜圖見圖1，各企業(yè)樣品有關物質(zhì)含量分布見圖2。

由圖1可知，不符合原料有關物質(zhì)標準規(guī)定的樣品的有關物質(zhì)色譜峰個數(shù)明顯多于符合標準規(guī)定樣品，同時前者的有關物質(zhì)含量明顯高于后者。由圖2可知，兩企業(yè)共8批次樣品不符合原料有關物質(zhì)標準規(guī)定，結果見表4。其余148批次樣品均符合原料有關物質(zhì)標準規(guī)定。

文獻報道慶大霉素對光、空氣、熱、稀酸與稀堿穩(wěn)定，在pH2～9的條件下加熱0.5h不影響其活性，120℃高壓滅菌1h其活性僅損失10%[13]。我科室承擔2012年國家藥品計劃抽驗品種硫酸慶大霉素注射液，其終端滅菌工藝為121℃，15min，經(jīng)探索性研究，注射液生產(chǎn)過程中未產(chǎn)生新的雜質(zhì)，雜質(zhì)含量也未增加[14]。本次硫酸慶大霉素片影響因素試驗表明硫酸慶大霉素性質(zhì)穩(wěn)定。綜合以上原因，分析該8批次樣品不符合原料有關物質(zhì)標準規(guī)定原因為企業(yè)采用不合格原料進行生產(chǎn)導致樣品有關物質(zhì)不符合規(guī)定。而現(xiàn)行質(zhì)量標準未控制有關物質(zhì)，僅控制效價含量，因此未能對藥物進行有效控制，存在藥物安全性風險，建議增加有關物質(zhì)檢查項。

3.2.3 慶大霉素C組分

采用新建方法對156批次樣品進行檢測，結果148批次樣品符合擬定標準規(guī)定，4批次樣品在擬定標準限度邊緣，4批次樣品不符合擬定標準規(guī)定。典型色譜圖見圖3。

慶大霉素C組分結果在擬定標準限度邊緣的4批次樣品與不符合擬定標準的4批次樣品的有關物質(zhì)項不符合原料有關物質(zhì)標準規(guī)定，因此進一步證明了上述8批次樣品不符合規(guī)定，分析原因為企業(yè)采用不合格的原料進行生產(chǎn)導致。結果見表4。

表3 影響因素樣品試驗結果Tab.3 Test results of in fl uence factor samples

圖1 硫酸慶大霉素片有關物質(zhì)HPLC色譜圖Fig.1 The chromatograms of related substances of gentamicin sulfate tablets

現(xiàn)有質(zhì)量標準僅對效價含量進行控制，未控制慶大霉素C組分與有關物質(zhì)。由表4可知，該8批次樣品效價法含量符合規(guī)定，按現(xiàn)有標準檢測產(chǎn)品合格，但根據(jù)探索性研究結果，該8批次樣品有關物質(zhì)不符合原料有關物質(zhì)規(guī)定，因此現(xiàn)有質(zhì)量標準不能有效控制產(chǎn)品的質(zhì)量，存在藥物有效性與安全性的風險。建議增加有關物質(zhì)與慶大霉素C組分檢查。

圖2 硫酸慶大霉素片有關物質(zhì)含量分布圖Fig.2 Distribution of relative substances of gentamicin sulfate

表4 不符合原料有關物質(zhì)標準規(guī)定樣品結果Tab.4 The results of the samples do not conform to the formulated standard

3.2.4 溶出行為

硫酸慶大霉素片易溶于水，口服基本不吸收，屬于BCSⅢ類(高溶解性低滲透性藥物)，在腸道中能達高濃度，用于治療腸道感染與結腸手術前準備，因此藥物的溶出是保證藥物有效性的關鍵因素。本次國家藥品計劃抽驗156批次樣品，包括素片12批(2企業(yè))，薄膜衣片27批次(1企業(yè))，糖衣片117批次(8企業(yè))。本次試驗選擇素片、薄膜衣片各1批次、糖衣片4批次(4企業(yè))分別進行在pH1.2鹽酸溶液、pH4.0醋酸鹽緩沖液、pH6.8磷酸鹽緩沖液、水4種介質(zhì)中溶出行為的研究。

結果薄膜衣片(批號：1508281，I企業(yè))、素片(批號：160601，J企業(yè))在pH1.2溶出介質(zhì)中，15min時的平均溶出度分別為94%和99%，均大于85%，參考文獻[15]要求，可知薄膜衣片與素片的溶出行為良好，不再進行另外3種溶出介質(zhì)中的研究。4個企業(yè)糖衣片在4種溶出介質(zhì)中的溶出曲線見圖4，糖衣片在4種溶出介質(zhì)中的批內(nèi)溶出度RSD圖見圖4。

由圖4～5可知，A企業(yè)的糖衣片(批號：150723)在pH1.2溶出介質(zhì)中溶出較快，在水中溶出較慢；批內(nèi)溶出度的RSD值在pH1.2溶出介質(zhì)中較小，在其余介質(zhì)中均較大，在水中最大。C企業(yè)的糖衣片(批號150402)在pH1.2溶出介質(zhì)中溶出較快，在其他3種溶出介質(zhì)中溶出行為基本一致；在4種介質(zhì)中樣品溶出度的RSD值均較大。E企業(yè)的糖衣片(批號：150901)在pH1.2溶出介質(zhì)中溶出較快，在其他3種溶出介質(zhì)中溶出稍慢；樣品溶出度的RSD值在pH1.2溶出介質(zhì)中較小，在其他3種溶出介質(zhì)中均較大。H企業(yè)的糖衣片(批號：20141005)在4種溶出介質(zhì)中溶出均較慢；樣品溶出度的RSD值在pH1.2溶出介質(zhì)中較小，在其余介質(zhì)中均較大。

圖3 慶大霉素C組分典型色譜圖Fig.3 The chromatograms of gentamicin C component

4個企業(yè)糖衣片在pH1.2溶出介質(zhì)中的溶出度大于80%的時間與崩解時限比較見表5。

采用SPSS軟件，對表5中溶出量超過80%所需時間和完全崩解時間進行雙變量相關分析，結果兩者相關系數(shù)為0.989，顯著性水平為0.011，小于0.05，表明兩者呈正相關。因此法定標準崩解時限檢查法能一定程度上反映樣品的溶出行為，可以不控制其溶出度。

圖4 不同企業(yè)糖衣片在4種溶出介質(zhì)中的溶出曲線Fig.4 Dissolution curves of sugar coated tablets from different enterprises in four dissolving media

圖5 不同企業(yè)糖衣片在4種溶出介質(zhì)中的批內(nèi)溶出度RSDFig.5 RSD of the dissolution of the batch of sugar coated tablets from different enterprises in four media

表5 糖衣片的溶出度與崩解時限Tab.5 Dissolution and disintegration time of sugar coated tablets

在禁食狀態(tài)下，胃內(nèi)滯留(排空)T50%時間為15～20min，對于某些高溶解性低滲透性藥物，以0.1mol/L 鹽酸溶液為介質(zhì)，在適當?shù)娜艹龆仍囼灄l件下，15min的溶出度大于85%時，可認為藥物制劑的生物利用度不受溶出行為的限制，即制劑的行為與溶液相似[15]，因此素片和薄膜衣片的溶出行為良好，對應的崩解時間分別為5與9min，表明素片和薄膜衣片劑型較合理，符合該藥品需要快速起效的要求。糖衣片中A與E企業(yè)的樣品在pH1.2溶出介質(zhì)中的溶出行為均較好，在另外3種溶出介質(zhì)中的溶出行為相對較差，對應的崩解時間分別為15與16min；C企業(yè)的樣品在pH1.2溶出介質(zhì)中的溶出行為一般，在另外3種溶出介質(zhì)中的溶出行為相對較差，其崩解時間為21min；H企業(yè)的樣品在4種溶出介質(zhì)中均緩慢溶出，不能滿足該藥品需要快速溶出的要求，其崩解時間為35min；因此提示H企業(yè)應考察并優(yōu)化片劑的處方與生產(chǎn)工藝，提高藥物的崩解速率，以確保藥物的有效性。4家糖衣片企業(yè)的樣品批內(nèi)溶出度RSD值均較大，表明批內(nèi)片劑質(zhì)量差異均較大，提示各生產(chǎn)企業(yè)應規(guī)范生產(chǎn)工藝，保證產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。

4 討論

4.1 片劑質(zhì)量

按法定標準對本次國家藥品計劃抽驗片劑檢驗，合格率100%，結合探索性研究結果，發(fā)現(xiàn)2家企業(yè)共8批次樣品的有關物質(zhì)不符合原料有關物質(zhì)標準規(guī)定，該8批次樣品中4批次的慶大霉素C組分不符合擬定標準規(guī)定，4批次在擬定標準規(guī)定低限，由于硫酸慶大霉素穩(wěn)定，生產(chǎn)工藝對產(chǎn)品質(zhì)量無影響，分析有關物質(zhì)與慶大霉素C組分不符合規(guī)定原因是企業(yè)采用不符合規(guī)定的原料進行生產(chǎn)。因為硫酸慶大霉素片主要用于治療腸道疾病，要求片劑能快速釋放起效，素片與薄膜衣片溶出行為良好，不同企業(yè)的糖衣片溶出行為不同，H企業(yè)糖衣片的溶出行為較差。綜上，硫酸慶大霉素片的質(zhì)量一般。

4.2 質(zhì)量標準可控性

硫酸慶大霉素片為臨床常用藥，生產(chǎn)量較大，臨床應用較廣泛。按法定標準檢驗，156批次樣品均符合規(guī)定，但通過探索性研究試驗，8批次樣品有關物質(zhì)不符合原料有關物質(zhì)標準規(guī)定，4批次樣品慶大霉素C組分不符合擬定標準規(guī)定，存在藥物安全性與有效性的隱患，現(xiàn)行標準僅通過效價法控制含量，效價法測定的是藥物中主要活性成分與其他微量組分等的綜合活性效價，效價法含量符合規(guī)定并不表明藥物的主要活性成分與其他微量組分符合規(guī)定。因此法定標準未能有效控制產(chǎn)品的質(zhì)量，建議增加慶大霉素C組分與有關物質(zhì)項，以保證藥物的安全有效。

4.3 劑型合理性

硫酸慶大霉素為水溶性藥物，但口服基本不吸收，在腸道能達高濃度，主要用于治療腸道疾病，要求片劑能快速釋放起效。因此，薄膜衣片與素片為較理想的劑型，能夠快速釋放達到治療效果，糖衣片在各溶出介質(zhì)中溶出相對緩慢，且批內(nèi)RSD相對較大，建議糖衣片企業(yè)優(yōu)化處方與生產(chǎn)工藝，保證藥物的有效性。