混菌發(fā)酵聯(lián)合分段控溫工藝提高柑橘皮渣可溶性膳食纖維含量

曹 艷，范 銘，童 創(chuàng)，陸勝民，*，楊 穎，邢建榮，鄭美瑜，唐偉敏，劉 哲

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學院 食品科學研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品采后處理重點實驗室，浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點實驗室，浙江 杭州 310021； 2.浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004)

柑橘是世界上產(chǎn)量最大的水果之一。我國是世界第一大柑橘生產(chǎn)國，2016年，我國柑橘產(chǎn)量約3 500萬t。皮和渣等副產(chǎn)物約占柑橘鮮重的30%～50%[1]，其中含有大量糖類、有機酸、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，以及黃酮、精油等有益成分[2]。目前，國內(nèi)只有小部分柑橘果皮用于提取果膠和香精油，以及入藥或加工成飼料，大部分皮渣被作為廢棄物直接丟棄，造成了極大的資源浪費。

膳食纖維是一類來源于植物的非淀粉多糖，分為可溶性膳食纖維(soluble dietary fiber， SDF)和不可溶性膳食纖維(insoluble dietary fiber， IDF)2類，具有調(diào)節(jié)腸道菌群、預(yù)防腸道疾病、輔助調(diào)節(jié)血糖血脂水平、預(yù)防心血管疾病等多種功效。SDF可溶于水，也可吸水膨脹，并能被腸道微生物酵解，主要包括果膠、植物膠、黏膠等。IDF不溶于水，也不能被腸道微生物酵解，主要包括纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等[3-5]。Schneeman等[6]提出，當膳食纖維中SDF的含量在30%～50%時，可達到平衡膳食的要求。目前市場上的膳食纖維主要來自谷物及豆渣、薯渣、甜菜渣等農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物，但其中SDF所占比例都很小(占副產(chǎn)物原料干重的4%～10%)[7-10]，不僅生理活性較低，而且口感粗糙，達不到平衡膳食的要求。Baker[11]和Grigelmo-Miguel等[12]研究表明，柑橘皮渣可以作為優(yōu)質(zhì)膳食纖維的制備原料，其SDF含量高于谷物來源的膳食纖維。因此，利用柑橘皮渣生產(chǎn)膳食纖維具有豐富的材料來源和良好的市場前景。

常規(guī)制備膳食纖維的方法有化學法、物理法、生物法等?；瘜W法、物理法制備過程中會產(chǎn)生大量廢水，對產(chǎn)品產(chǎn)量及產(chǎn)物性能無明顯的改善作用；而利用微生物發(fā)酵法制備膳食纖維，條件溫和且綠色環(huán)保[13-16]。目前，已有以柑橘皮渣或其他水果皮渣為原料通過固態(tài)發(fā)酵法制備SDF的研究[1，17-18]，但基本采用單一種類的發(fā)酵菌株和恒定發(fā)酵條件，總膳食纖維(total dietary fiber， TDF)和SDF比例提高有限。

本文在前期研究基礎(chǔ)上進一步優(yōu)化發(fā)酵工藝，采用混菌發(fā)酵聯(lián)合分段控溫工藝，提高臍橙皮渣發(fā)酵產(chǎn)物中TDF和SDF含量，制備高品質(zhì)柑橘膳食纖維。同時，研究了該工藝對浙江主栽柑橘品種皮渣發(fā)酵生產(chǎn)膳食纖維的適用性，旨在擴大柑橘皮渣原料范圍，提高資源利用率，減少環(huán)境污染。

1 材料與方法

1.1 主要原料

取贛南臍橙、溫州蜜柑和常山胡柚剝皮分瓣后榨汁，將殘留的皮和渣分別烘干至手抓成團、落地即散的程度(含水量約70%)，冷凍保存。其中：贛南臍橙為本研究的主要原料，用于確定提高SDF含量的最佳發(fā)酵工藝；溫州蜜柑和常山胡柚作為代表性柑橘皮渣原料，用于對最佳發(fā)酵工藝的適用性進行驗證。

1.2 菌種

青霉菌Penicilliumsp. CIs14，實驗室自行篩選的可產(chǎn)高活性纖維素酶的菌株，適用于柑橘皮渣發(fā)酵生產(chǎn)膳食纖維，經(jīng)口急性毒性實驗證明無毒[19]。菌種保存于-80 ℃冰箱，培養(yǎng)基上活化長出孢子后用于發(fā)酵種子培養(yǎng)。

植物乳桿菌Lactobacillusplantarum，實驗室自行篩選。菌種保存于-80 ℃冰箱，發(fā)酵之前經(jīng)培養(yǎng)基活化。

1.3 培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件

植物乳桿菌種子培養(yǎng)液：蛋白胨1.0%(質(zhì)量分數(shù)，下同)，牛肉膏1.0%，酵母提取液0.5%，葡萄糖2.0%，乙酸鈉 0.5%，檸檬酸氫二胺0.2%，吐溫-80 0.1%，K2HPO40.2%，MgSO4·7H2O 0.02%，MnSO4·7H2O 0.005%，110 ℃滅菌20 min。將活化后的植物乳桿菌接種于培養(yǎng)基中，28 ℃靜置培養(yǎng)2～3 d。

青霉菌柑橘皮渣種子培養(yǎng)基：柑橘皮和渣按2∶1(質(zhì)量比)混合均勻，添加蛋白胨0.2%(質(zhì)量分數(shù)，下同)、酵母粉0.1%、MgSO4·7H2O 0.1%，110 ℃滅菌20 min。將活化后的青霉菌孢子制成孢子懸浮液，接入培養(yǎng)基中，接種量10%(質(zhì)量分數(shù))，在28 ℃、相對濕度60%～80%條件下培養(yǎng)3～4 d[19]。

柑橘皮渣發(fā)酵培養(yǎng)基：柑橘皮和渣按2∶1(質(zhì)量比)混合均勻，添加蔗糖2%(質(zhì)量分數(shù)，下同)、蛋白胨0.2%、酵母粉0.1%、KH2PO40.37%、K2HPO40.11%、(NH4)2SO40.3%、MgSO4·7H2O 0.22%，攪拌均勻，分裝于500 mL燒杯中，厚度3～5 cm，110 ℃滅菌20 min。

單一菌種發(fā)酵工藝(工藝1)：柑橘皮渣發(fā)酵培養(yǎng)基接種10%(質(zhì)量分數(shù))植物乳桿菌或青霉菌，在28 ℃、相對濕度60%～80%條件下培養(yǎng)2或5 d。

青霉菌發(fā)酵聯(lián)合分段控溫工藝(工藝2)：柑橘皮渣發(fā)酵培養(yǎng)基中接種10%(質(zhì)量分數(shù))青霉菌，在28 ℃、相對濕度60%～80%條件下培養(yǎng)5 d，向發(fā)酵結(jié)束的皮渣中添加100～200 mL無菌水，攪拌均勻，在45 ℃條件下100 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h。

混菌發(fā)酵工藝(工藝3)：柑橘皮渣發(fā)酵培養(yǎng)基中先接種10%(質(zhì)量分數(shù)，下同)植物乳桿菌，28 ℃培養(yǎng)2 d后，接種10%青霉菌種子培養(yǎng)基，在28℃、相對濕度60%～80%條件下培養(yǎng)5 d。

混菌發(fā)酵聯(lián)合分段控溫工藝(工藝4)：柑橘皮渣發(fā)酵培養(yǎng)基中先接種10%(質(zhì)量分數(shù)，下同)植物乳桿菌，28 ℃培養(yǎng)2 d后，接種10%青霉菌，繼續(xù)于28 ℃、相對濕度60%～80%條件下培養(yǎng)5 d。向發(fā)酵結(jié)束的皮渣中添加1.5倍體積無菌水，攪拌均勻，在45 ℃條件下100 r·min-1放置24 h。

1.4 發(fā)酵樣品后處理

將不同種類柑橘皮渣或發(fā)酵產(chǎn)物于80 ℃烘至恒重，粉碎，過50目篩。過篩后的粉末樣品用于測定TDF、SDF和IDF含量。

1.5 膳食纖維提取及含量測定

稱取烘干粉碎過篩后的樣品10 g置于燒杯中，各加入250 mL pH 6.8的PBS緩沖液，超聲30 min至樣品完全分散。加入1 mL木瓜蛋白酶溶液(25 kU·mL-1)，用鋁箔蓋住，60 ℃超聲30 min，過濾。濾渣用蒸餾水洗滌3次，每次100 mL，收集合并洗滌液，轉(zhuǎn)移至燒杯中，加入4倍體積的95%(體積分數(shù)，下同)乙醇(預(yù)熱至60 ℃)，用鋁箔蓋住燒杯，室溫沉淀1 h，過濾，殘渣分別用150 mL 78%乙醇、95%乙醇和丙酮各沖洗2次，50 ℃烘干并稱量，得到SDF含量。殘渣分別用150 mL 78%乙醇、95%乙醇和丙酮各沖洗2次，50 ℃烘干、稱量，得到IDF含量[20]，計算得到TDF含量及SDF/TDF。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均采用Excel 2010進行整理，并在SPSS 19.0軟件上進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一菌種發(fā)酵柑橘皮渣產(chǎn)物中TDF和SDF的含量

從表1可以看出，單獨接種植物乳桿菌發(fā)酵后的臍橙皮渣中SDF和TDF含量分別為25.8%和81.7%，SDF/TDF為31.5%，比未發(fā)酵的臍橙皮渣分別提高150.5%、35.0%和85.3%。單獨接種青霉菌發(fā)酵后的臍橙皮渣中SDF和TDF含量分別為31.4%和88.6%，SDF/TDF為35.5%，比未發(fā)酵的臍橙皮渣分別提高204.9%、46.4%和108.8%。

表1不同發(fā)酵條件下臍橙皮渣中SDF、IDF和TDF的含量

Table1Contents of SDF， IDF and TDF in navel orange peel and pomace under different treatments

%

同列數(shù)據(jù)后無相同字母的表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Data marked without the same letters in the same column indicated significant difference atP<0.05. The same as below.

2.2 不同發(fā)酵工藝下臍橙皮渣中TDF和SDF的含量

如表2所示，相較于青霉菌發(fā)酵(工藝1)，青霉菌發(fā)酵聯(lián)合分段控溫工藝(工藝2)和混菌發(fā)酵工藝(工藝3)下，SDF含量和SDF/TDF顯著(P<0.05)提高，但工藝2和工藝3下各指標并無顯著差異。在混菌發(fā)酵聯(lián)合分段控溫工藝下，發(fā)酵產(chǎn)物中SDF含量和SDF/TDF比單獨接種青霉菌發(fā)酵下分別提高33.8%和30.1%，且較工藝2和工藝3條件下也有顯著(P<0.05)提高。

2.3 混菌發(fā)酵聯(lián)合分段控溫工藝的適用性

從表3可以看出，采用混菌發(fā)酵聯(lián)合分段控溫工藝的蜜柑和胡柚皮渣中SDF、TDF含量和SDF/TDF均比未發(fā)酵皮渣顯著(P<0.05)提高， SDF含量和SDF/TDF分別比單獨接種青霉菌發(fā)酵條件下提高25.6%和22.3%以上。

表2不同發(fā)酵工藝下發(fā)酵產(chǎn)物中膳食纖維各組分含量

Table2Contents of SDF， IDF and TDF under different fermentation technologies

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表中工藝1僅采用青霉菌單獨發(fā)酵。

In the above table， technology 1 only appliedPenicilliumsp. Cis14 during the fermentation.

表3蜜柑和胡柚皮渣經(jīng)發(fā)酵后膳食纖維中SDF、IDF、TDF含量及SDF/TDF

Table3Contents of SDF， IDF and TDF and SDF/TDF in peel and pomace fromCitrusunshiuMarc. and Changshan Hu-You before and after fermentation

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3 討論

本研究通過比較不同發(fā)酵工藝條件下贛南臍橙皮渣發(fā)酵產(chǎn)物中的SDF、TDF含量和SDF/TDF，提出能夠顯著提高臍橙皮渣中SDF、TDF含量和SDF/TDF的混菌發(fā)酵聯(lián)合分段控溫工藝。利用該工藝發(fā)酵臍橙皮渣后，SDF、TDF含量和SDF/TDF高于單獨以青霉菌發(fā)酵條件下的對應(yīng)指標。該工藝同樣適用于以溫州蜜柑和常山胡柚皮渣為原料生產(chǎn)高品質(zhì)膳食纖維。

植物乳桿菌是以纖維類原料制備膳食纖維的常用菌株之一，發(fā)酵過程中產(chǎn)生以乳酸為主的大量有機酸，使纖維素的糖苷鍵斷裂，打斷纖維素大分子的長鏈結(jié)構(gòu)，破壞纖維素原料致密結(jié)構(gòu)，從而提高可溶性膳食纖維的含量，但其作用部位一般在物料表面[16-17，21]。青霉菌分泌的纖維素酶(內(nèi)切纖維素酶、β-葡萄糖苷酶和濾紙酶)具有較強的纖維素分解能力，可以結(jié)合到纖維素大分子上將其水解成可溶于水的分子量較小的糖類，同時降低纖維素的聚合度[17，22]。酶水解纖維素是目前兼具環(huán)保綠色、轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點的處理方式[23]。因此，利用青霉菌發(fā)酵提高柑橘皮渣中可溶性膳食纖維含量的效果優(yōu)于植物乳桿菌，這與本研究結(jié)果一致。目前報道的可用于發(fā)酵法制備膳食纖維的菌種主要為綠色木霉，但前期研究表明，本研究所用青霉菌對柑橘皮渣的發(fā)酵性能亦優(yōu)于綠色木霉[19]。

利用發(fā)酵法制備膳食纖維過程中，植物乳桿菌和青霉菌的作用原理不同[16，24]。已有研究表明，先通過物理作用使纖維素結(jié)構(gòu)膨大，然后添加適量纖維素酶，可大幅提高纖維素的水解率[25]。常用纖維素酶的最適溫度范圍為45～75 ℃，但發(fā)酵過程中的溫度僅適合菌體大量生長和酶的合成，并不是纖維素酶水解底物的最適溫度[22，24]。因此，單獨接種青霉菌的發(fā)酵條件下，雖然菌體大量生長并分泌了足夠的纖維素酶，但纖維素酶的活力并沒有達到最大，導(dǎo)致臍橙皮渣中纖維素水解率較低，使得SDF和TDF含量的提高幅度較小。因此，有必要將不同發(fā)酵條件組合進行分步發(fā)酵，充分發(fā)揮不同條件的優(yōu)勢作用，進一步提高SDF、TDF含量及SDF/TDF[1]。本試驗結(jié)果顯示，在混菌發(fā)酵聯(lián)合分段控溫條件下，發(fā)酵產(chǎn)物中SDF含量和SDF/TDF比單獨接種青霉菌發(fā)酵條件下顯著提高33.8%和30.1%。據(jù)此，我們推測：首先接種植物乳桿菌發(fā)酵后，所產(chǎn)乳酸會破壞臍橙皮渣中表面的纖維結(jié)構(gòu)，使得臍橙表面纖維結(jié)構(gòu)膨大、疏松，暴露出更多的纖維素酶作用位點[21]，這使得第二步接種青霉菌發(fā)酵所產(chǎn)的纖維素酶與皮渣中纖維素的可及度和有效接觸面積增加，從而提高了臍橙皮渣中纖維素的水解率，最終使得發(fā)酵后的臍橙皮渣中SDF含量和SDF/TDF大幅提高。

浙江省是我國柑橘主產(chǎn)區(qū)之一，不僅種植面積大，而且品種繁多?；旌暇N發(fā)酵聯(lián)合分段控溫工藝是以臍橙皮渣為原料提出的，因此，本研究特別選擇了另外2種具有代表性的柑橘品種——溫州蜜柑和常山胡柚驗證該工藝的適用性。結(jié)果顯示，該工藝對于不同品種的柑橘皮渣適用性良好，且該工藝對柑橘皮渣中SDF含量和SDF/TDF提高幅度高于已有的研究報道[18]。

今后，筆者團隊將從原料纖維結(jié)構(gòu)變化、發(fā)酵產(chǎn)品粒徑分析及纖維素組成等方面深入研究該工藝提高SDF、TDF含量和SDF/TDF的作用機理，進一步指導(dǎo)、改進發(fā)酵工藝，充分運用柑橘皮渣資源生產(chǎn)高品質(zhì)膳食纖維。