牦牛瘤胃微生物研究進(jìn)展

梁澤毅，張劍搏，李 晨，丁學(xué)智

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050）

瘤胃是目前已知纖維素類(lèi)物質(zhì)降解速率最快的生物反應(yīng)器，而牦牛作為常年生活于低壓缺氧、嚴(yán)寒、食物匱乏的青藏高原上的大型家畜，較其他反芻動(dòng)物擁有更快的纖維素降解速率。相關(guān)研究表明，瘤胃發(fā)酵的效率越高，所合成的發(fā)酵終產(chǎn)物就越好。目前，研究者們采用傳統(tǒng)分離鑒定方法和分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)牦牛瘤胃微生物的種類(lèi)和數(shù)量進(jìn)行了大量研究。發(fā)現(xiàn)牦牛瘤胃內(nèi)部的微生物包括細(xì)菌、原菌、古菌、原蟲(chóng)以及噬菌體等，若以細(xì)胞個(gè)數(shù)計(jì)算，瘤胃微生物的總細(xì)胞數(shù)是反芻動(dòng)物自身細(xì)胞數(shù)的10倍以上［1］，通常情況下每毫升瘤胃內(nèi)容物中有不同種類(lèi)細(xì)菌數(shù)量1010～1011個(gè)、原蟲(chóng)數(shù)量 105～106個(gè)、厭氧真菌（游離孢子數(shù)為 103～105個(gè)）和少數(shù)噬菌體它們相互作用與反芻動(dòng)物共生［2］。Xue等［3］應(yīng)用細(xì)菌16S rRNA基因和mcrA基因克隆文庫(kù)的高通量測(cè)序來(lái)研究瘤胃原核生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，牦牛瘤胃原核生物群落由29門(mén)，40綱，63目，77科和79屬組成，其中數(shù)量最多的是厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)以及變形菌門(mén)。Chevalier等［4］研究發(fā)現(xiàn)，疣微菌門(mén)可以幫助牦牛在寒冷脅迫下提高自身的能量轉(zhuǎn)化效率以抵御寒冷。但是瘤胃內(nèi)的微生物關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜，這一巨大的微生物資源有待進(jìn)一步發(fā)掘。因此，本文對(duì)牦牛瘤胃微生物的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，旨在為牦牛瘤胃微生物資源利用提供參考。

1 不同品種牛瘤胃微生物間的差異

牦牛是世界上唯一能夠在海拔3 000～5 000 m的高山地區(qū)和亞高山地區(qū)生活的大型反芻動(dòng)物，其天然的獨(dú)特性，引發(fā)科研人員的研究興趣。Ding等［5］研究發(fā)現(xiàn)，牦牛瘤胃中甲烷菌的多樣性高于其他反芻家畜。更早的研究證明，牦牛在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成了適應(yīng)青藏高原極端環(huán)境的特定機(jī)制，使其消化和代謝與其他反芻家畜有較大差異，這可能也是牦牛甲烷排放量較低的原因。安登弟［6］通過(guò)對(duì)牦牛瘤胃微生物基因組文庫(kù)構(gòu)建16S rDNA生物多樣性的研究發(fā)現(xiàn)，牦牛瘤胃微生物以降解纖維素的微生物為主，降解淀粉的微生物較少；而黃牛的瘤胃中則分解纖維素的微生物較少，分解淀粉的微生物較多，這可能與牦牛生存環(huán)境和其采食有關(guān)。劉開(kāi)朗等［7］通過(guò)對(duì)魯西肉牛、荷斯坦奶牛、晉南牛、牦牛、黃牛和Hanwoo六個(gè)不同品種牛的瘤胃微生物群落進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)牛的品種是造成瘤胃細(xì)菌群落差異的重要因素，且品種對(duì)瘤胃細(xì)菌群落的影響大于日糧或其他因素。

2 不同年齡段牦牛瘤胃微生物的變化

在整個(gè)生命周期中，牦牛瘤胃微生物的數(shù)量、種類(lèi)處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。反芻動(dòng)物出生時(shí)其消化道微生物并不像成年反芻動(dòng)物那樣豐富，出生時(shí)消化道內(nèi)不存在厭氧細(xì)菌、厭氧真菌和原蟲(chóng)，在與母體及外界環(huán)境不斷接觸的過(guò)程中，微生物區(qū)系才在瘤胃及其他消化道部位逐漸建立起來(lái)。?Rskov等［8］研究發(fā)現(xiàn)，每一生長(zhǎng)階段的牦牛瘤胃微生物的數(shù)量和種類(lèi)都存在差異，在哺乳階段牦犢牛瘤胃并未發(fā)育完全，只能通過(guò)食管溝反射將乳汁直接導(dǎo)入皺胃進(jìn)行消化吸收，此階段牦牛的消化代謝方式與其他單胃動(dòng)物相似，主要以化學(xué)消化為主，但隨著其年齡的增長(zhǎng)、采食方式的改變以及各類(lèi)瘤胃微生物的定植，逐漸形成了以分解纖維素類(lèi)的微生物為主的瘤胃微生物。Mao等［9］研究發(fā)現(xiàn)，成年牦牛和老年牦牛瘤胃微生物古菌序列不僅有公共的序列，同時(shí)也有各自的特有序列，表明成年牦牛和老年牦牛的瘤胃微生物的種類(lèi)存在差異。Jiao等［10］的研究結(jié)果表明，厚壁菌門(mén)在3個(gè)優(yōu)勢(shì)種群（厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)）中所占的比例最高，不同年齡組之間維持在50%左右，而其他反芻動(dòng)物則是以擬桿菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌群。但是擬桿菌門(mén)的增加呈現(xiàn)出了階梯式的增長(zhǎng)，這也從另一方面證明瘤胃微生物的增長(zhǎng)并不是只與年齡有關(guān)，也可能和采食的日糧類(lèi)型有著密切的關(guān)系［11］。廣古菌門(mén)在牦牛瘤胃細(xì)菌/甲烷菌定植過(guò)程中隨年齡呈增加的趨勢(shì)。變形菌門(mén)主要負(fù)責(zé)降解日糧中的可溶性糖、脂肪和氨基酸。幼年牦牛以母乳作為唯一日糧，乳中富含這些營(yíng)養(yǎng)成分。但是當(dāng)牦牛開(kāi)始采食牧草，其瘤胃微生物中變形菌門(mén)迅速降低。放線菌門(mén)和梭桿菌門(mén)也呈現(xiàn)出隨著年齡的增加而降低的趨勢(shì)，但是它們?cè)陉笈Ａ鑫钢械谋壤哂谄渌雌c動(dòng)物，在反芻動(dòng)物出生時(shí)，瘤胃并不是嚴(yán)格的厭氧環(huán)境，需要高比例放線菌門(mén)來(lái)促使牦牛瘤胃更迅速地消耗掉瘤胃內(nèi)的氧氣并建立厭氧的環(huán)境，讓牦犢牛更快形成穩(wěn)定、成熟的瘤胃微生物環(huán)境，以適應(yīng)惡劣的生長(zhǎng)條件。Jami等［12］飼喂給6月齡和2周歲牛相同的飼料，發(fā)現(xiàn)2組牛的瘤胃微生物仍然存在顯著差異，表明在6月齡時(shí)，飼料種類(lèi)對(duì)瘤胃微生物的影響明顯低于年齡對(duì)其的影響。Van［13］研究發(fā)現(xiàn)，在幼年和成年動(dòng)物瘤胃中的細(xì)菌群落幾乎沒(méi)有共同的菌屬。這可能是因?yàn)樵诔錾淖畛鯉滋炱淞鑫干形撮_(kāi)始活動(dòng)，故沒(méi)有參與飼料的消化。細(xì)菌群落中的同組相似性隨著年齡的增長(zhǎng)而增加。這表明成熟的瘤胃環(huán)境雖然更加多樣化，但是相對(duì)于原始環(huán)境，是一個(gè)更加特殊、更加均質(zhì)的細(xì)菌群落。牦牛瘤胃微生物在牦牛的不同生長(zhǎng)時(shí)期存在變化，這與其生長(zhǎng)階段和營(yíng)養(yǎng)來(lái)源有著密切的關(guān)系。

3 瘤胃微生物隨季節(jié)變化的規(guī)律

牦牛主要分布在青藏高原，其主要植被為高寒草甸，但是由于牧草冷季遠(yuǎn)比暖季長(zhǎng)，牧草生長(zhǎng)期較短而枯草期較長(zhǎng)，且牦牛飼養(yǎng)方式基本以放牧為主，致使牦牛處于“夏飽、秋肥、冬瘦、春乏”的循環(huán)［14］。在枯草期，牧草中的纖維含量高于暖季（夏季），牦牛為了生存就必須擁有更高效的消化系統(tǒng)，而瘤胃作為消化系統(tǒng)中主要的消化器官，其內(nèi)部的微生物群系會(huì)伴隨著季節(jié)變化而產(chǎn)生微小的變動(dòng)。有研究發(fā)現(xiàn)，反芻動(dòng)物瘤胃中的疣微菌門(mén)在冷季的比例要高于暖季，大量的疣微菌可幫助機(jī)體在寒冷脅迫下提高機(jī)體的能量轉(zhuǎn)化效率，而黏膠球形菌門(mén)也有類(lèi)似的趨勢(shì)，這兩種菌門(mén)可能在應(yīng)對(duì)寒冷脅迫方面作用相同。牦牛瘤胃微生物的季節(jié)變化主要受所采食的牧草營(yíng)養(yǎng)成分和環(huán)境氣溫變化。米見(jiàn)對(duì)［11］從門(mén)水平上研究了牦牛瘤胃微生物受季節(jié)影響的情況，發(fā)現(xiàn)不同季節(jié)牦牛瘤胃微生物的豐富度存在差異，見(jiàn)圖1。姚軍等［15］通過(guò)研究牦牛和藏羊瘤胃內(nèi)纖毛蟲(chóng)在冷季和暖季的變化，發(fā)現(xiàn)牦牛、藏羊瘤胃內(nèi)的纖毛蟲(chóng)在冷季時(shí)的數(shù)量明顯少于暖季，并且纖毛蟲(chóng)的組成也存在明顯差異；纖毛蟲(chóng)中降解纖維素的雙毛屬、前毛屬、頭毛屬在冷季占比高于暖季。牦牛瘤胃季節(jié)性的變化表明與外界環(huán)境有著密切關(guān)系。在食物短缺的冷季牦牛需要更多的能量維持生存，瘤胃中降解纖維素的菌種數(shù)量增多，纖毛蟲(chóng)數(shù)量減少。

圖1 不同季節(jié)牦牛瘤胃細(xì)菌/古菌門(mén)水平的組成［11］

4 牦牛瘤胃微生物的影響因素

瘤胃作為一個(gè)重要的天然發(fā)酵罐，依賴(lài)瘤胃內(nèi)大量微生物群體的協(xié)同作用，將反芻動(dòng)物攝入的纖維類(lèi)物質(zhì)快速降解轉(zhuǎn)化成一系列機(jī)體所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。瘤胃微生物作為可降解、轉(zhuǎn)化植物纖維素類(lèi)物質(zhì)效率最高的天然體系，也受各種因素的影響。Shanks等［16］的研究結(jié)果表明，不同飼喂條件下牛腸道內(nèi)的微生物群落結(jié)構(gòu)和種類(lèi)都存在差異，且在不同飼糧條件下的微生物群體結(jié)構(gòu)有明顯的不同。Shanks等［17］在體外人工模擬瘤胃發(fā)酵試驗(yàn)中，采用特定氨基酸缺省底物的方法研究了微生物自身的限制性氨基酸，結(jié)果表明，氨基酸限制性作用的大小排序：支鏈氨基酸＞芳香族氨基酸＞蛋氨酸＞賴(lài)氨酸；細(xì)菌和原蟲(chóng)內(nèi)部菌群結(jié)構(gòu)也發(fā)生了相應(yīng)的變化。Bao等［18］研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃正常發(fā)揮功能，主要依靠的是內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，而pH值和揮發(fā)性脂肪酸對(duì)瘤胃內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定發(fā)揮著重要的作用，牦牛瘤胃內(nèi)pH值保持在6～7，pH值的變化直接影響纖維素降解菌的活性。當(dāng)pH值低于6.2時(shí)，纖維素的降解會(huì)受到抑制。許黛君［19］研究發(fā)現(xiàn)，揮發(fā)性脂肪酸也為瘤胃微生物提供了適宜的生存條件，牦牛瘤胃內(nèi)的碳水化合物經(jīng)過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸，它是牦牛主要的能量來(lái)源，也是牦牛合成乳脂和體脂的原料。同時(shí)揮發(fā)性脂肪酸的存在又在調(diào)節(jié)瘤胃滲透壓和pH值等方面發(fā)揮了作用，為瘤胃微生物降解纖維素提供了良好的保障。瘤胃微生物的組成也受日糧精粗比的影響，精料飼養(yǎng)模式會(huì)增加瘤胃淀粉降解菌的數(shù)量，而粗料的供給會(huì)促進(jìn)纖維降解菌的生長(zhǎng)。楊宏波等［20］的研究表明，高精料全價(jià)顆粒飼料雖然對(duì)犢牛瘤胃TVFA、乙酸、丁酸和乙酸/丙酸的水平起到促進(jìn)作用，但對(duì)瘤胃纖維降解菌和厭氧真菌有顯著的抑制作用，適當(dāng)?shù)拇至瞎┙o會(huì)有利于瘤胃健康發(fā)育和反芻行為的形成［21］。但需要注意的是幼年動(dòng)物對(duì)于纖維物質(zhì)的降解功能尚不完善，若過(guò)早或過(guò)多地飼喂粗飼料，不利于反芻動(dòng)物瘤胃的發(fā)育。Jiao等［22］采用對(duì)比試驗(yàn)研究了放牧和圈養(yǎng)2種不同飼養(yǎng)方式對(duì)山羊瘤胃功能和微生物定植的影響，發(fā)現(xiàn)不同管理模式與山羊瘤胃中的相關(guān)酶類(lèi)、生理形態(tài)以及微生物的定植有密切關(guān)系。綜上所述，影響牦牛瘤胃微生物的變化因素，一方面是源于自身，如受遺傳因素、自身瘤胃的調(diào)節(jié)、生長(zhǎng)發(fā)育階段、年齡等的影響；另一方面來(lái)源于外界環(huán)境，如采食日糧的種類(lèi)、季節(jié)的變化、生長(zhǎng)的環(huán)境氣候等。因此，牦牛瘤胃能否健康而快速的發(fā)育，取決于是否有健康的微生物定植于瘤胃系統(tǒng)，而不同的管理模式和飼養(yǎng)水平對(duì)瘤胃微生物的定植過(guò)程有重要影響，其具體影響作用有待詳細(xì)研究。

5 小結(jié)

瘤胃作為反芻動(dòng)物體消化道內(nèi)的黑匣子，其內(nèi)部大量的微生物之間相互作用成為一個(gè)密不可分的整體，構(gòu)成了一個(gè)生態(tài)系統(tǒng)。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，人們利用宏基因組學(xué)將所有瘤胃微生物的基因看作整體進(jìn)行分析，越來(lái)越多的微生物功能已被發(fā)現(xiàn)。未來(lái)隨著宏基因組、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)、宏蛋白組學(xué)以及代謝組學(xué)的相互結(jié)合，從基因、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯及翻譯后的水平上共同研究牦牛瘤胃微生物群落的結(jié)構(gòu)、代謝功能和調(diào)控規(guī)律已成為可能。從不同年齡、不同季節(jié)瘤胃微生物以及犢牛瘤胃微生物的定植結(jié)果來(lái)看，在未來(lái)的研究中，將某一消化功能較強(qiáng)的反芻瘤胃微生物移植到這方面較弱的反芻動(dòng)物體內(nèi)，或是按照前一種動(dòng)物的瘤胃微生物的分布對(duì)后一種動(dòng)物瘤胃微生物進(jìn)行調(diào)控是可行的。