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    BMP4和SMAD4基因在公綿羊繁殖相關(guān)組織的表達(dá)

    2019-03-29 07:32:46采復(fù)拉大木拉田志龍段新華儲(chǔ)明星
    關(guān)鍵詞:蘇尼特繁殖力小尾寒羊

    采復(fù)拉·大木拉 ,田志龍 ,段新華 ,儲(chǔ)明星

    (1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,農(nóng)業(yè)部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193;2.新疆畜牧科學(xué)院畜牧業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所,烏魯木齊 830000;3.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,洛陽(yáng) 471003)

    轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β(Transforming growth factor-β,TGF-β)超家族可以調(diào)節(jié)動(dòng)物細(xì)胞的增殖、分化、凋亡,影響動(dòng)物的胚胎發(fā)育、器官形成以及細(xì)胞外基質(zhì)合成和穩(wěn)態(tài)[1]。近些年研究發(fā)現(xiàn),TGF-β超家族對(duì)胚胎原始生殖細(xì)胞形成[2]、睪丸發(fā)育、生殖細(xì)胞增殖分化[3]、動(dòng)物出生后睪丸正常功能維持[4]、精子生成等過(guò)程發(fā)揮著重要的生理調(diào)控作用。BMP4基因作為TGF-β超家族成員,參與多種生命活動(dòng),促進(jìn)小鼠精原干細(xì)胞的分化[3]。Smad4蛋白是TGF-β超家族的常見(jiàn)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子,參與TGF-β超家族所有成員的信號(hào)傳導(dǎo)。Smad4在小鼠睪丸中表達(dá),并且被認(rèn)為在睪丸發(fā)育和精子發(fā)生過(guò)程中起重要作用[5]。目前,對(duì)于BMP4和SMAD4的研究比較多,但BMP4和SMAD4基因?qū)d羊繁殖性狀的作用模式還未確定。因此,本研究以低繁殖力蘇尼特羊公羊和高繁殖力小尾寒羊公綿羊?yàn)樵囼?yàn)材料,采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)BMP4和SMAD4基因在不同繁殖力公羊下丘腦-垂體-睪丸軸等組織中的表達(dá),以探索BMP4和SMAD4基因在公綿羊繁殖中的作用,為深入理解公綿羊繁殖機(jī)理提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 樣品采集

    小尾寒羊來(lái)自山東省鄆城縣大鵬農(nóng)牧科技有限公司,蘇尼特羊來(lái)自內(nèi)蒙古烏拉特中旗。從中隨機(jī)挑選性成熟且健康狀況良好的公羊各3只。屠宰后分別采集大腦、小腦、下丘腦、垂體、輸精管、腎上腺、睪丸和附睪組織,液氮中保存直至提取RNA。RNA提取試劑盒購(gòu)于天根生化科技有限公司(北京),反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量染料均購(gòu)于大連寶生物;2×Taq PCR Master Mix購(gòu)于拓英坊科技有限公司(北京)。

    1.2 RNA提取和檢測(cè)

    使用試劑盒提取組織總RNA(詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)),使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性,利用儀器測(cè)定其純度和濃度。

    1.3 引物設(shè)計(jì)

    利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量引物。以RPL19基因做內(nèi)參基因。引物具體信息見(jiàn)表1。

    表1 綿羊BMP4、SMAD4和RPL19基因的引物序列和產(chǎn)物大小

    1.4 熒光定量PCR

    試驗(yàn)用cDNA合成及RT-PCR和熒光定量PCR試驗(yàn)過(guò)程參考文獻(xiàn) [6]。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒提供步驟進(jìn)行cNDA的合成,使用2×Taq PCR Master Mix對(duì)目的基因進(jìn)行PCR,最后使用SYBR?PremixExTaqTMⅡ進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。熒光定量PCR數(shù)據(jù)處理參考文獻(xiàn)[6],即以 RPL19 為內(nèi)參基因,使用 2-△△CT法[7]計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量,采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,使用鄧肯氏(Duncan's)進(jìn)行多重比較。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 RNA提取與cDNA合成

    利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA完整性進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,RNA完整性良好。使用內(nèi)參基因?qū)DNA進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示(圖1),目的片段與預(yù)期的一致,可用于后續(xù)的熒光定量試驗(yàn)。

    圖1 cDNA電泳檢測(cè)

    2.2 BMP4和SMAD4基因在不同品種公羊繁殖相關(guān)組織中的表達(dá)

    運(yùn)用qPCR對(duì)小尾寒羊公羊和蘇尼特羊公羊8種繁殖相關(guān)組織中BMP4和SMAD4基因的表達(dá)量進(jìn)行了研究,結(jié)果見(jiàn)圖2。兩個(gè)品種比較發(fā)現(xiàn),BMP4和SMAD4在公綿羊各種組織中均有表達(dá),其中BMP4基因在睪丸中高表達(dá),其次是輸精管、腎上腺,在其他組織中均呈痕量表達(dá)。SMAD4基因在睪丸、下丘腦、小腦、大腦中高表達(dá),在其他組織中均中等表達(dá)。BMP4基因在低繁殖力蘇尼特公羊睪丸中表達(dá)量顯著高于高繁殖力小尾寒羊公羊(P<0.05)。SMAD4基因在低繁殖力蘇尼特公羊8種組織表達(dá)量均顯著高于高繁殖力小尾寒羊公羊(P<0.05)。

    圖2 BMP4和SMAD4基因在不同品種公羊繁殖相關(guān)組織中的表達(dá)

    3 討論

    骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族中最大的一個(gè)亞家族[8]。BMP4是BMP亞家族中的重要成員之一,在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮廣泛的調(diào)控作用。在生殖系統(tǒng)調(diào)節(jié)中,睪丸和卵巢是BMP4作用的重要靶器官[9]。研究發(fā)現(xiàn),BMP4不但可促進(jìn)初級(jí)卵泡轉(zhuǎn)化為次級(jí)卵泡[10],還可促進(jìn)牛卵巢原始卵泡以及次級(jí)卵泡直徑的增加并調(diào)控牛卵母細(xì)胞成熟[11]。徐業(yè)芬[12]發(fā)現(xiàn),BMP4抗體處理湖羊卵母細(xì)胞可以導(dǎo)致其凋亡并消失。推測(cè)BMP4基因是原始卵泡和卵母細(xì)胞生存必需因子,可促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞進(jìn)一步分化,排卵卵泡進(jìn)一步成熟,最終表現(xiàn)為排卵數(shù)增加。BMP4基因不僅在綿羊卵巢中發(fā)揮作用,還在山羊中也發(fā)揮著重要功能[13]。秦立紅等[14]報(bào)道,BMP4基因在草原紅牛不同發(fā)育時(shí)期睪丸組織中均有表達(dá),這說(shuō)明BMP4基因在草原紅牛睪丸組織中可能發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn),BMP4基因在低繁殖力蘇尼特公羊睪丸中表達(dá)量顯著高于高繁殖力小尾寒羊公羊(P<0.05),這和前人研究結(jié)果基本一致。

    TGF-β超家族信號(hào)通路在卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞生長(zhǎng)以及顆粒細(xì)胞增殖、哺乳動(dòng)物睪丸發(fā)育及精子形成中起重要作用。Smad4作為該信號(hào)通路的中心分子在TGF-β 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起關(guān)鍵作用[15]。王玉恒等[16]研究發(fā)現(xiàn),Smad4在牦牛的多個(gè)組織中均有表達(dá),尤其是在生殖系統(tǒng)的卵巢、輸卵管、子宮組織中廣泛表達(dá)。郝曉霞[17]研究發(fā)現(xiàn),Smad4在小鼠睪丸支持細(xì)胞、萊氏細(xì)胞、管周肌樣細(xì)胞和除長(zhǎng)形精子之外的所有生殖細(xì)胞中表達(dá)。在支持細(xì)胞中敲除Smad4能夠影響胎兒睪丸索擴(kuò)張,單獨(dú)敲除萊氏細(xì)胞中的Smad4對(duì)胎兒及成年鼠睪丸發(fā)育無(wú)影響。在支持細(xì)胞和萊氏細(xì)胞中同時(shí)敲除Smad4,能夠?qū)е滦∈蟛G丸不育和腫瘤形成。高真真[18]使用免疫印跡法和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Smad4在成年鵪鶉和雞的睪丸生殖細(xì)胞和支持細(xì)胞中高表達(dá)。本研究表明,SMAD4基因在睪丸、下丘腦、小腦、大腦中高表達(dá),且低繁殖力蘇尼特羊公羊顯著高于高繁殖力小尾寒羊公羊(P<0.05),再次驗(yàn)證了SMAD4基因?qū)τ诓G丸功能以及相關(guān)繁殖組織的重要作用。

    4 結(jié)論

    本研究發(fā)現(xiàn),BMP4和SMAD4基因在小尾寒羊公羊和蘇尼特羊公羊睪丸中高表達(dá),并且在蘇尼特羊睪丸中的表達(dá)量顯著高于小尾寒羊(P<0.05)。表明BMP4和SMAD4基因在公綿羊繁殖中起一定程度的負(fù)調(diào)控作用,這為公綿羊高繁殖性狀選育提供了參考依據(jù)。

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