苦瓜揮發(fā)油超臨界二氧化碳 萃取工藝優(yōu)化及其抗炎活性研究

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(1.國家中醫(yī)藥管理局亞健康干預技術實驗室,湖南長沙 410128; 2.湖南農(nóng)業(yè)大學園藝園林學院,湖南長沙 410128; 3.湖南農(nóng)業(yè)大學，湖南省作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用重點實驗室,湖南長沙 410128; 4.湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心,湖南長沙 410128)

苦瓜(MomordicacharantiaL.)是葫蘆科屬植物,果實夏秋季節(jié)成熟,可做日常食用,鮮片晾干后具有清熱解毒,祛暑明目的功效,可降血糖、抗病毒、抗腫瘤、抗炎等[1]。世界各地種植廣泛,具有較大的開發(fā)價值?？喙系鞍?、多肽、多糖、皂苷、植物凝集素等在國內(nèi)外研究較多[2-5],其活性成分主要有輔助抗氧化、輔助降血糖和降脂、免疫調(diào)節(jié)等作用。其中苦瓜調(diào)節(jié)炎癥反應在諸多功能中扮演重要角色。炎癥反應主要是由氧代謝增強、脂質(zhì)體氧化、感染等激活,它能促使免疫細胞增殖、分化,對機體起到保護作用;然而過度的炎癥反應會造成病理性的免疫疾病,危害機體的正常生理功能,造成動脈粥樣硬化、胰島素抵抗及其他自身免疫疾病,其中一氧化氮的表達會增強巨噬細胞炎癥,促進粥樣動脈硬化等疾病[6]。因此調(diào)節(jié)人體的炎癥對維持人體健康有著重要所用。

研究表明苦瓜提取物在調(diào)節(jié)炎癥方面具有良好的作用。何利惠等[7]發(fā)現(xiàn):α-苦瓜素可顯著加強小鼠巨噬細胞對肥大細胞的殺傷作用;陳彥光等[8]研究表明β-苦瓜素能夠顯著抑制小鼠脾細胞由脂多糖誘導而產(chǎn)生的促有絲分裂癥狀,延遲小鼠的過敏反應;張曉峰[9]研究表明苦瓜提取物可通過抑制NF-kB的信號通路,降低炎癥因子一氧化氮(NO)和腫瘤壞死因子-α的釋放。目前國內(nèi)外對苦瓜揮發(fā)油的研究較少,隨著揮發(fā)油萃取技術的發(fā)展,天然揮發(fā)油的抗炎作用逐漸被人們發(fā)現(xiàn),其中魚腥草素[10]、丹皮酚[11]、樟腦[12]等廣泛應用于炎癥引起的疾病。超臨界CO2流體萃取技術近年來廣泛應用,尤其適用于天然揮發(fā)油的開發(fā),采用該方法具有無溶劑殘留、萃取效率高、萃取溫度低等優(yōu)勢,主要應用于醫(yī)藥、食品、化妝品等領域[13]。脂多糖能誘導小鼠巨噬細胞向經(jīng)典的巨噬細胞M1型極化,分泌大量的炎癥因子NO[14],常用于活性物質(zhì)抗炎功能評價。

針對目前苦瓜揮發(fā)油研究現(xiàn)狀及其提取物具有顯著的抗炎活性的潛力,本文以苦瓜為原料,以揮發(fā)油得率為指標,利用Box-Behnke響應面法(RSM)研究影響超臨界CO2萃取苦瓜揮發(fā)油的主要因素及其相互關系。評價了苦瓜揮發(fā)油對脂多糖(LPS)誘導的巨噬細胞釋放炎癥因子NO的影響。為苦瓜揮發(fā)油的抗炎活性物質(zhì)的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦瓜(苦瓜干飲片) 青春康健藥材公司,產(chǎn)地為廣西;正己烷 色譜純,國藥集團化學試劑有限公司;CO2純度99.5%以上,長沙市特種氣體廠;小鼠RAW 264.7巨噬細胞 中國科學院細胞庫;一氧化氮試劑盒 南京建成生物工程研究所。

6850型色譜儀、5975C型質(zhì)譜儀 含Agilent 化學工作站,美國Agilent公司;PL403電子天平 Mettler Toledo公司;ZN-400A型高速中藥粉碎機 中南制藥機械廠;HA231-50-06型超臨界萃取設備 江蘇南通華安超臨界萃取有限公司;GENios酶標儀 瑞士Tecan;HERA CELL 150培養(yǎng)箱 美國Kecdro。

1.2 實驗方法

1.2.1 單因素實驗 萃取壓力、萃取溫度、萃取時間、CO2流量以及物料顆粒影響萃取的得率,苦瓜質(zhì)地疏松,易于CO2流體在物料內(nèi)擴散所以流量和粉碎粒度對苦瓜揮發(fā)油得率影響較小,所以選擇萃取壓力、萃取溫度、萃取時間為單因素實驗條件。固定條件為500 g粉碎至20目苦瓜干粉，置于5 L萃取釜中，超臨界CO2流量20 L/h,萃取溫度45 ℃,萃取時間90 min,考察不同萃取壓力(10、15、20、25、30 MPa)對苦瓜揮發(fā)油得率的影響;固定條件為500 g粉碎至20目苦瓜粉，置于5 L萃取釜中，超臨界CO2流量20 L/h,萃取壓力25 MPa,萃取時間90 min,考察不同萃取溫度(35、40、45、50、55 ℃)對苦瓜揮發(fā)油得率的影響;固定條件為500 g粉碎至20目苦瓜粉，置于5 L萃取釜中，超臨界CO2流量20 L/h,萃取溫度25 MPa,萃取溫度50 ℃,考察不同萃取時間(30、60、90、120 min)對苦瓜揮發(fā)油得率的影響。

揮發(fā)油得率(%)=萃取揮發(fā)油量/苦瓜干質(zhì)量×100

1.2.2 響應面試驗設計 根據(jù)單因素實驗結果,采用Box-Behnken 3因素3水平的響應面(RSM)設計,考察萃取壓力、萃取溫度、萃取時間對苦瓜揮發(fā)油得率的影響,得出二次多項回歸方程擬合并做優(yōu)化分析。苦瓜揮發(fā)油萃取試驗設計見表1。

表1 Box-Behnken實驗因素水平編碼表Table 1 Factors levels and codingTable of Box-Behnken design experiment

1.2.3 揮發(fā)油成分檢測 采用GC-MS檢測。將獲得的苦瓜揮發(fā)油稀釋10-3倍溶于正己烷,過0.45 μm膜;色譜柱為毛細管HP-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm),初始柱溫50 ℃,程序升溫10 ℃/min升溫至160 ℃,再以20 ℃/min升溫至320 ℃。進樣口溫度280 ℃(99.999% He),流速1 mL/min,進樣量1 μL;分流比10∶1,EI離子源,電子能量70 eV,離子源溫度250 ℃;溶劑延遲3 min,質(zhì)核比掃描范圍(35～550 m/z)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 萃取壓力對苦瓜揮發(fā)油得率的影響 如圖1，壓力能夠影響超臨界CO2密度,密度與揮發(fā)油的溶解度相關。在45 ℃時,隨著萃取壓力的增大揮發(fā)油得率顯著增加,當增加到一定程度后,揮發(fā)油收率增速緩慢,且萃取壓力過大,易產(chǎn)生溝流現(xiàn)象使原料板結。由圖1可見當壓力從10 MPa增大到25 MPa時苦瓜揮發(fā)油得率明顯增加,當壓力達到30 MPa后,苦瓜揮發(fā)油得率不再增加,考慮各方面因素后,選25 MPa為最佳萃取壓力。

圖1 萃取壓力對苦瓜揮發(fā)油得率影響Fig.1 Influence of extraction pressure on the extraction rate of volatile oil from M. charantia L.

2.1.2 萃取溫度對苦瓜揮發(fā)油得率的影響 溫度能夠影響CO2在物料中的擴散速度。由圖2可知，隨著溫度的升高,苦瓜揮發(fā)油得率隨之升高,當溫度高于50 ℃后,苦瓜揮發(fā)油得率下降,這是因為隨著溫度的升高,超臨界CO2流體粘度減小,擴散系數(shù)增加,CO2流體滲透能力增強,傳質(zhì)速率提高,苦瓜揮發(fā)油得率也隨之增加。當溫度高于50 ℃,超臨界CO2流體密度降低,此時擴散系數(shù)難以補償密度減小造成的溶解能力下降。并且繼續(xù)升高溫度可能造成熱敏性物質(zhì)的變性,所以選50 ℃為最佳的溫度條件。

圖2 萃取溫度對苦瓜揮發(fā)油得率的影響Fig.2 Influence of extraction temperature on the extraction rate of volatile oil from M. charantia L.

2.1.3 萃取時間對得率的影響 如圖3，萃取時間越久萃取越完全,當萃取時間達到90 min后,繼續(xù)增加時間得率無明顯變化,說明此時揮發(fā)油已萃取完全,所以選取90 min為最佳萃取時間。

圖3 萃取時間對苦瓜揮發(fā)油得率的影響Fig.3 Influence of extraction time on the extraction rate of volatile oil from M. charantia L.

2.2 響應面優(yōu)化結果

根據(jù)萃取苦瓜揮發(fā)油單因素實驗結果結合Box-behnken中心組合原理設計實驗,以萃取壓力、萃取溫度、萃取時間為自變量,以苦瓜揮發(fā)油得率為響應值。

分析表2數(shù)據(jù)得到苦瓜揮發(fā)油得率(%)與萃取壓力(X1)、溫度(X2)和萃時間(X3)3因素得到回歸方程:

表2 Box-Behnken試驗設計和結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3 響應值方差分析表Table 3 Variance analysis of response value

2.2.3 響應面優(yōu)化條件 從圖4可見各因素對響應值的影響，響應曲面的走勢及坡度可體現(xiàn)試驗因素對響應值的影響。圖4b響應面曲線陡峭、等高線密集、形狀為橢圓形,表明萃取壓力和萃取時間交互作用對苦瓜油得率影響極顯著(p<0.01);圖4a與圖4b相比,響應面曲線走勢較平緩、等高線較稀疏、形狀為橢圓形,表明萃取壓力和萃取溫度的交互作用對苦瓜油得率影響顯著(p<0.05),但弱于萃取壓力和時間的相互作用;圖4c響應面曲線走勢平緩、等高線稀疏、形狀為圓形,表明萃取壓力和萃取時間的交互作用對苦瓜油得率影響不明顯。

圖4 兩因素的交互作用對苦瓜揮發(fā)油得率的影響Fig.4 Effects of interaction of two factors on the yield of volatile oil from M. charantia L.

通過軟件分析得到最佳萃取條件為萃取壓力26.97 MPa,萃取溫度50.16 ℃,萃取時間88.39 min,苦瓜揮發(fā)油最大得率為2.577%,根據(jù)實際條件修正后得到最佳條件:萃取壓力27 MPa,萃取溫度50 ℃,萃取時間90 min,在此條件下進行3次重復實驗平均得率為2.56%,響應面分析與實際值誤差小,能夠預測實驗結果。

2.3 成分分析

由超臨界CO2萃取出的苦瓜揮發(fā)油具有苦瓜特有的香味,經(jīng)GC-MS檢測,其主要成分見表4,總離子流色譜圖(圖5),采用G1701DA質(zhì)譜工作站,檢索NIST02質(zhì)譜庫,對各個組分進行結構確定,用峰面積歸一法對各組分進行定量,得出苦瓜揮發(fā)油中不同脂肪酸的相對含量。GC/MS分析結果顯示,苦瓜揮發(fā)油的成分以酚類、酯類、烷烴類、烯烴類物質(zhì)為主,與賈素花等[16]報道的苦瓜揮發(fā)油相比,其酚類物質(zhì)百分比含量明顯提高,可能是賈素花等采用的蒸餾法所得苦瓜揮發(fā)油中酚類物質(zhì)分子質(zhì)量小、易揮發(fā)、在萃取過程中損失。目前對苦瓜果實、莖、葉[17]揮發(fā)油研究較少,且萃取技術多為蒸餾及有機溶劑萃取,本研究采用超臨界CO2萃取的苦瓜揮發(fā)油酚類含量最高,達到67.33%,其他酯類含量18.54%,烷烴類含量15.54%,烯烴類含量4.15%。

表4 苦瓜揮發(fā)油成分組成Table 4 Composition of volatile oil from M. charantia L. extracted with supercritical CO2

圖5 苦瓜揮發(fā)油總離子流圖Fig.5 TIC curves of volatile oils from M. charantia L.

2.4 苦瓜揮發(fā)油對RAW 264.7細胞NO釋放水平的影響

見表5中脂多糖能誘導RAW 264.7細胞向M1極化,隨著苦瓜揮發(fā)油濃度的升高,RAW 264.7細胞釋放炎癥因子NO水平逐漸降低。與模型組相比,16、32 mg/mL劑量的苦瓜油對小鼠NO的分泌水平有具有顯著的調(diào)節(jié)作用,說明苦瓜揮發(fā)油具有一定的抗炎作用。研究發(fā)現(xiàn),酚類成分能夠下調(diào)環(huán)氧合酶2及一氧化氮合酶基因表達,升高Bcl-2蛋白表達等降低了炎性因子NO、白介素6、腫瘤壞死因子等釋放,增強巨噬細胞吞噬作用,減少炎癥損傷的功能[18-22]。苦瓜揮發(fā)油的主要成分為酚類,推測苦瓜揮發(fā)性酚類能抑制LPS誘導的巨噬細胞釋放NO。

表5 苦瓜揮發(fā)油對LPS誘導 RAW 264.7巨噬細胞釋放NO的影響Table 5 Effects of volatile oil from M. charantia L. on the secretion of NO of RAW 264.7 cells induced by LPS

3 結論

本文研究苦瓜揮發(fā)油的超臨界CO2萃取工藝優(yōu)化，分析了揮發(fā)油的主要成分,評價了揮發(fā)油對炎癥因子一氧化氮(NO)釋放的影響。超臨界CO2流體的萃取溫度對苦瓜揮發(fā)油得率有極顯著性影響(p<0.01),而萃取壓力和萃取時間對苦瓜揮發(fā)油得率有顯著影響(p<0.05),響應面分析得到萃取的最優(yōu)條件是:萃取壓力27 MPa,萃取溫度50 ℃,萃取時間90 min,此條件下苦瓜揮發(fā)油平均得率為2.56%,與預測結果相近。GC-MS分析結果顯示苦瓜揮發(fā)油的主要成分為酚類,相對百分含量達到了67.33%。抗炎分析結果表明苦瓜揮發(fā)油對LPS誘導的RW 264.7巨噬細胞釋放炎癥因子NO的抑制有一定的劑量效應,且在揮發(fā)油濃度達到16、32 mg/mL時具有顯著性差異(p<0.05)。揮發(fā)性酚類具有抗炎活性,且為苦瓜揮發(fā)油的主要成分,推測苦瓜揮發(fā)性酚類是抑制LPS誘導的巨噬細胞釋放NO的主要成分。

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