白花蛇舌草注射劑調(diào)節(jié)Bcl-2/CytC信號通路誘導(dǎo)線粒體凋亡抑制肝癌細胞增殖的研究

崔 宏，高琴琴，王效謙，萬百順，張 玲

鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院(河南省腫瘤醫(yī)院)(鄭州 450008)

肝癌在我國發(fā)病率較高,是我國最常見的惡性腫瘤之一,可分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類。原發(fā)性肝癌源于肝臟上皮組織，是危害極大的惡性腫瘤，而繼發(fā)性肝癌相比原發(fā)性較少見，一般見于其他的惡性腫瘤轉(zhuǎn)移。 目前臨床上對肝癌常用手術(shù)治療,對采用局部切除同時結(jié)合放射治療與化療等綜合治療,但是總體預(yù)后較差。越來越多的中藥被用于治療肝癌?，F(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)和中藥學(xué)研究數(shù)據(jù)表明,白花蛇舌草注射劑具有抗腫瘤,抗氧化,抗菌,增強非特異性免疫和保護神經(jīng)系統(tǒng)的功能，特別是在近年來，由于白花蛇舌草注射劑對惡性腫瘤和部分炎性疾病療效顯著，在臨床實踐中得到了廣泛的應(yīng)用，實踐闡明，白花蛇舌草注射劑可以阻抑很多種腫瘤細胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，如成人膠質(zhì)細胞瘤 U87細胞、腹水腫瘤 S 180細胞、人乳腺癌 McF-7細胞等[1]，本文以人肝癌Bcl-2細胞為探究對象，探索白花蛇舌草注射劑是否通過Bcl-2/CytC信號通路調(diào)控人肝癌HepG2細胞的增殖和凋亡,現(xiàn)報告如下。

資料與方法

1 一般資料 選取2015年1月至2018年6月收治的120例肝癌患者臨床資料進行分析，將其按照治療方案不同分成參照組30例，研究組90例，其中研究組根據(jù)白花蛇舌草注射劑的不同濃度分為低濃度組，中低濃度，高濃度組各30例，男90例，女60例；年齡60～82歲，平均(70.6±8.3)歲；病程3～12年，平均(6.2±3.5)年，納入標準：患者經(jīng)細胞學(xué)或組織病理學(xué)檢查確診，可耐受局部藥物治療，臨床依從性好；排除標準：心、肝、腎功能不全者，生物制劑過敏者，1個月內(nèi)予以胸腔內(nèi)注入藥物治療者。各組性別比例、年齡、病程等比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

2 研究方法 研究組根據(jù)白花蛇舌草注射劑的不同濃度分為研究組1，研究組2，研究組3各30例，參照組不做任何處理，研究組進行體外培養(yǎng)人細胞癌細胞株HepG2，白花蛇舌草注射劑處理細胞后24 h和48 h分別觀察細胞生長情況，逆向顯微鏡和透射電鏡觀察細胞形態(tài)，Western Blot檢測 Bax，Bcl-2，Caspase-3，Cyt C蛋白表達情況。

2.1 細胞培養(yǎng)：HepG2細胞在含牛血清和100 (g/ml)鏈霉素混合物的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于適宜條件的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔一天換一次液，取用對數(shù)生長期的肝癌細胞，用于實驗[2]。

2.2 MTT法檢測白花蛇舌草注射液對HepG2細胞增殖的影響：取對數(shù)生長期的HepG2細胞，將細胞種于96孔板中，濃度每孔180 μl，接著加入白花蛇舌草注射液20 μl,使得每孔的終濃度分別為0 (空白對照) 、25、50、100 μg/ml,對照組加入順鉑20 μl,每組設(shè)置3個復(fù)孔。將處理好的細胞置細胞培養(yǎng)箱中孵育(條件為：37 ℃, 5% CO2及飽和濕度)，培養(yǎng)24、48 h后，每孔分別加入5 mg / ml MTT溶液20 μl,振蕩2 min混勻，期間注意避光,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,吸進孔內(nèi)混合試劑,再在每個孔中加入DMSO 150 μl,至于搖臺避光振蕩10 min,充分混勻后,放入酶標儀中,測定每孔吸光度 (OD) 值。

2.3 倒置顯微鏡及透視電鏡觀察細胞形態(tài)：不同濃度的白花蛇舌草注射液處理后的Hep G2細胞24 h后，置于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化；白花蛇舌草注射液處理后的HepG2細胞，離心收集后，采用0. 25% 戊二醛將其固定。乙醇脫水后,采用LR White包埋,切片,醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色后,鏡下觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化。

2.4 WB檢測Bax，Bcl-2，Caspase-3，CytC蛋白表達情況：取生長狀態(tài)良好的HepG2細胞，低溫下提取蛋白，煮沸變性，經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜，一抗4℃冰箱過夜，TBST清洗，10 ming/次，二抗孵育搖床孵育1.5 h，加入顯色劑，冷CCD顯色。

結(jié)果

1 白花蛇舌草注射液對人肝癌細胞增殖的作用 在24 h和48 h后，濃度為50 μg/ml和100 μg/ml時，HepG2細胞的存活率明顯下降。抑制率隨藥物濃度的增加和作用時間的延長而增加，呈劑量依賴性和時間依賴性關(guān)系，在50 μg/ml和100 μg/ml濃度下，白花蛇舌草注射液對HepG2細胞有明顯的抑制作用(P<0.05)，白花蛇舌草注射液濃度為25 μg/ml時對Hep G2也有一定促進增殖的作用。見表1。

表1 白花蛇舌草注射液對人肝癌細胞增殖的作用

2 白花蛇舌草注射液對HepG2細胞形態(tài)的影響 白花蛇舌草注射液能后改變HepG2細胞的超微結(jié)構(gòu)，參照組細胞核較大,細胞核清晰,有豐富的細胞器,線粒體呈圓形或橢圓形,細胞核染色質(zhì)均勻分布,而當白花蛇舌草注射液劑量達到100 μg/ml時，微絨毛,胞質(zhì)變性,空泡,細胞染色質(zhì)固縮,邊緣,有細胞凋亡的早期跡象。

3 Western blot檢測蛋白表達水平 分別用低、中、高三個濃度白花蛇舌草注射液預(yù)處理HepG2細胞，24 h后，與對照組和化療組相比，Bax、CytC、Caspase-3蛋白表達逐漸升高，Bcl-2蛋白表達逐漸降低，Bcl-2/Bax比值降低。其中,當濃度為50 μg/ml和100 μg/ml時作用最為明顯,結(jié)果表明白花蛇舌草注射液可以抑制HepG2細胞的Bax、Bcl -2蛋白的表達。通過抑制Bcl-2蛋白的表達,減少Bcl-2與Bax之間的比例，釋放Cyt C,激活Caspase-3相關(guān)的凋亡路徑,誘導(dǎo)肝癌細胞的凋亡。見表2。

表2 白花蛇舌草注射液作用24 h后蛋白表達的影響

討論

肝細胞癌是一種病程短、生存時間短、預(yù)后不良的常見的惡性腫瘤,我國是一個肝癌高發(fā)的國家，肝癌死亡率是占世界上肝癌死亡率的45%。目前,治療肝細胞癌(HCC)是手術(shù)和化療的相互結(jié)合，尋找有效的治療肝癌的中成藥具有一定的意義，白花蛇舌草注射液已廣泛應(yīng)用于臨床，因其療效顯著逐漸成為研究熱點[3-5]。本研究顯示，當白花蛇舌草注射液濃度為50 μg/ml和100 μg/ml時，HepG2細胞存活率顯著下降，抑止率隨藥物濃度的增長和效用時間的拉長而增加，呈現(xiàn)出劑量和時間的依賴性關(guān)系。在50 μg/ml和100 μg/ml濃度下，白花蛇舌草注射液對HepG2細胞有明顯的抑制作用(P<0.05)；在這項研究中,發(fā)現(xiàn)25μg/ml濃度的白花蛇舌草注射液能夠促進腫瘤腫瘤細胞的生長,但是當濃度進一步增加時，白花蛇舌草注射液具有抑制人肝癌HepG2細胞增殖的能力，此外，隨著藥物濃度和時間的增加，其抑制作用逐漸增強，且呈劑量-時間依賴性。此外，大多數(shù)抗腫瘤藥物都能抑制腫瘤細胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡并且形態(tài)變化可以直接反映藥物治療后腫瘤細胞的變化[6-8]。在本實驗中，白花蛇舌草注射液可以改變HepG2細胞超微結(jié)構(gòu),其中對照組線粒體呈圓形或橢圓形,細胞核染色質(zhì)均勻分布,但是當白花蛇舌草注射液劑量達到100 μg/ml時,微絨毛,胞質(zhì)出現(xiàn)變性,細胞染色質(zhì)固縮，細胞出現(xiàn)早期凋亡的特征。

細胞凋亡的主要途徑有以下幾種，外部方法稱為死亡受體途徑和以線粒體為主的內(nèi)部方式內(nèi)源性凋亡。線粒體信號通路在調(diào)節(jié)細胞凋亡中起著重要的作用[9],線粒體的第二個主要功能就是參與細胞能量代謝,通過呼吸鏈來影響ATP的生成，同時與DNA損傷、細胞衰老和細胞死亡都有著密切的聯(lián)系。Bcl-2家族作為凋亡相關(guān)基因在線粒體凋亡通路中發(fā)揮重要作用，關(guān)于Bcl-2家族調(diào)控線粒體外膜通透性的機制，假說之一是，細胞接受凋亡信號后促凋亡因子Bax和Bak發(fā)生寡聚化，從細胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到線粒體外膜上，并與膜上的電壓依賴陰離子通道相互作用，使通道開放到足以使線粒體內(nèi)的凋亡因子如細胞色素c等釋放到細胞質(zhì)基質(zhì)中，引起細胞死亡[10]。本研究中Western blot結(jié)果顯示白花蛇舌草注射液能夠調(diào)節(jié)HepG2細胞中Bcl-2/Cyt C信號通路相關(guān)蛋白的表達，在100 μg/ml、50 μg/ml、25 μg/ml的白花蛇舌草注射劑預(yù)期處理24h后，與對照組相比，CytC、Bax、Caspase-3蛋白表達逐漸升高，Bcl-2/Bax比值也降低[11-14]。其中,100 μg/ml和50 μg/ml濃度最為顯著。結(jié)果表明白花蛇舌草注射液可以調(diào)控Bcl-2蛋白的表達,抑制Bcl-2蛋白的表達,能夠釋放Cyt C,激活Caspase-3蛋白質(zhì)的表達,誘導(dǎo)肝癌細胞的凋亡[15]，在這項研究中,我們發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草注射液可以有效的調(diào)節(jié)Bcl-2，Bax，Caspase-3蛋白質(zhì)的表達，使Caspase-3蛋白質(zhì)逐漸增加并且使Bcl-2蛋白表達逐漸降低，從而誘導(dǎo)肝癌細胞的凋亡[16]。

綜上所述，白花蛇舌草注射液能夠抑制人肝癌Hep G2細胞的增殖并且能夠誘導(dǎo)其凋亡，這可能與Bcl-2 /CytC信號通路的調(diào)控有關(guān)。