蘇云金芽孢桿菌以色列亞種毒素蛋白定量檢測方法分析

金海燕 胡凌云 劉荷梅

摘要：為完善蘇云金芽孢桿菌以色列亞種（Bacillus thuringrensis subsp. israelensis）毒素蛋白定量檢測方法，試驗用一定濃度的磷酸緩沖溶液、純化水洗滌蘇云金芽孢桿菌以色列亞種試樣，去除培養(yǎng)基殘留。用SDS-PAGE電泳法檢測離心后收集到的試樣菌體毒素蛋白含量。結(jié)果表明，通過磷酸緩沖液及水洗滌試樣，解決了試樣中雜質(zhì)干擾毒素蛋白含量檢測的關(guān)鍵性問題，采用該方法能夠準確對蘇云金芽孢桿菌以色列亞種兩種主要相對分子質(zhì)量的毒素蛋白進行檢測與定量，且重復(fù)性好，檢測誤差可以控制在5%以內(nèi)，并且檢測結(jié)果與產(chǎn)品生物效價存在顯著相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：蘇云金芽孢桿菌以色列亞種（Bacillus thuringrensis subsp. israelensis）；毒素蛋白；SDS-PAGE凝膠；電泳

中圖分類號：TQ453.5；O657.8 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）03-0096-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.03.026 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Abstract： To provide a quantitative detection method for toxin protein of Bacillus thuringrensis subsp. israelensis （Bti），and to improve the quality control technique. The samples of Bacillus thuringrensis subsp. israelensis were washed in water with a certain concentration of phosphoric acid buffer solution， and the residue of culture medium was removed. The bacterial toxin protein collected after centrifugation was detected by SDS-PAGE electrophoresis and the content was determined. The key problem of the determination of impurity interfering toxin protein in the sample was solved by washing the sample with phosphoric acid buffer and water. This method can accurately detect and quantify the two major molecular weight toxin proteins of Bacillus thuringrensis subsp. israelensis. The method was used to detect the subspecies of Bacillus thuringrensis subsp. israelensis. The results were reproducible， the detection error could be controlled within 5% of the average value， and there was a significant correlation between the detection results and the biological titer of the products. The method is reasonable in conception and simple in operation， and can provide reference for further product quality management.

Key words： Bacillus thuringrensis subsp. israelensis； toxin protein； SDS-PAGE gel； electrophoresis

蚊類是“四害”之一，目前世界上已知的有3 200余種，中國記載已達360多種。蚊蟲不僅叮咬人和動物，還傳播瘧疾、登革熱病、流行性乙肝病、淋巴絲蟲病、黃熱病等流行疾病[1-6]。據(jù)統(tǒng)計，全球每年有5億人被按蚊傳播的瘧疾感染，其中200萬是非洲兒童；非洲、亞洲、中南美洲，這些地區(qū)每年至少100萬人死于登革熱，1萬人死于黃熱病[7]。此外有些伊蚊將嗜睡性腦炎病毒傳染給人類，每年致使約3萬人喪命。蘇云金芽孢桿菌以色列亞種（Bacillus thuringrensis subsp. israelensis，簡稱Bti）具有很強的殺幼蚊活性[8]，對非靶標生物安全，是目前用于蚊蟲防治的重要微生物菌株[9]。目前，這種細菌的應(yīng)用范圍進一步擴大，Bti作為生物制劑廣泛應(yīng)用于控制各種作物和森林、果樹、蔬菜、茶葉害蟲[10]。在Bti類產(chǎn)品生產(chǎn)與流通過程中，需要對產(chǎn)品進行產(chǎn)品質(zhì)量檢測與控制，然而國內(nèi)目前尚未有針對Bti類產(chǎn)品質(zhì)量的檢測標準，因此需要針對Bti類產(chǎn)品質(zhì)量檢測方法進行研究。

Bti殺幼蚊產(chǎn)品的主要有效成分是由殺蟲蛋白組成的伴孢晶體。當(dāng)幼蚊取食伴孢晶體后，晶體首先在堿性腸道內(nèi)溶解釋放原毒素，進一步經(jīng)蛋白質(zhì)水解酶作用形成活化毒素片段。毒素隨后與中腸上皮細胞作用，導(dǎo)致腸上皮細胞穿孔、腫脹并裂解，最終導(dǎo)致幼蟲死亡[11，12]。目前最常用的Bti殺幼蚊產(chǎn)品檢測方法是生物測定[13]，世界衛(wèi)生組織（WHO）對Bti生物測定制定了相應(yīng)的標準，規(guī)定了供試昆蟲為埃及伊蚊[14，15]，同時也有用搖蚊[16，17]、中華按蚊[18]、三帶喙庫蚊[19]等作為供試昆蟲測其毒力效價的報道。但生物測定受靶標昆蟲質(zhì)量、數(shù)量及外界條件等影響，檢測誤差較高，因此，需要建立更可靠的檢測方法。Bt殺蟲劑的主要殺蟲成分是殺蟲蛋白，中國國標與化工行業(yè)標準均采用SDS-PAGE凝膠電泳的方法測定Bt類產(chǎn)品的晶體蛋白含量。本研究在前期生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)按照Bt 16 000 IU/mg可濕性粉劑標準（HG 3617-1999）中毒素蛋白檢測方法難以檢測Bti殺幼蚊產(chǎn)品的殺蟲蛋白含量。本研究參考Bt 16 000 IU/mg可濕性粉劑標準（HG 3617-1999）中毒素蛋白檢測方法，針對Bti殺幼蚊產(chǎn)品進行了方法改進，建立適合Bti殺幼蚊產(chǎn)品的檢測方法。并且分析了不同發(fā)酵批次產(chǎn)品的殺蟲蛋白含量與殺蟲效價的關(guān)系，殺蟲蛋白含量與殺蟲效價有顯著相關(guān)性。相關(guān)研究結(jié)果不僅可以指導(dǎo)Bti類產(chǎn)品的生產(chǎn)過程，更好地控制Bti類產(chǎn)品的質(zhì)量，還可以為進一步制定Bti類生物農(nóng)藥質(zhì)量標準提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

四甲基乙二胺（TMED），分析純；0.55 mol/L氫氧化鈉溶液；10%過硫酸銨溶液（10%AP）；10%十二烷基硫酸鈉溶液（10% SDS）。

0.1 mo1/L磷酸緩沖液（pH 8.0）：稱取1.77 g無水磷酸氫二鉀至250 mL燒杯中，加入0.1 mol/L無水磷酸二氫鉀溶液6 mL（13.61 g磷酸二氫鉀溶解至1 000 mL水中），加水溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，加水定容。

30%丙烯酰胺母液（30% ACR-BIS）：稱取丙烯酰胺（ACR）29.0 g、亞甲基雙丙烯酰胺（BIS）1.0 g，溶于100 mL水中，中速定性濾紙過濾，于4 ℃暗處貯存?zhèn)溆谩?/p>

pH 8.8分離膠緩沖溶液：稱取三羥基甲基氨基甲烷（Tris）30.25 g，溶于水中，用濃鹽酸調(diào)至pH 8.8，用水定容至250 mL。

pH 6.8濃縮膠緩沖溶液：稱取三羥基氨基甲烷（Tris）12.10 g，溶于水中，用濃鹽酸調(diào)至pH 6.8，用水定容至100 mL。

pH 8.3電極緩沖溶液：稱取三羥基甲基氨基甲烷（Tris）3.03 g，甘氨酸14.42 g，十二烷基硫酸鈉（SDS）1.0 g，溶于水中，用濃鹽酸調(diào)至pH 8.3，用水定容至1 000 mL。

樣品稀釋液：1 mol/L pH 6.8濃縮膠緩沖液18.75 mL，十二烷基硫酸鈉6.0 g，甘油30 mL，巰基乙醇15 mL，少許溴酚藍，用水定容至100 mL。

染色液：稱取考馬斯亮藍（CBB）R-250 1.0 g，加入甲醇450 mL、冰乙酸100 mL、水450 mL，溶解混勻，過濾備用。

脫色液：量取甲醇100 mL、冰乙酸35 mL于1 000 mL容量瓶中，加水定容。

漂洗液：量取無水乙醇300 mL、冰乙酸100 mL、水600 mL，混勻。

固定液：量取75 mL冰乙酸于1 000 mL容量瓶中，加水定容。

毒素蛋白標準品：毒素蛋白（相對分子質(zhì)量為130 ku）含量為11.7%，由美國CY公司提供。

1.2 儀器

垂直電泳儀，直流電源；夾芯式垂直電泳槽；灌膠模具；10.5 cm×10.0 cm玻璃板2套；10孔樣品梳1把。電泳凝膠成像系統(tǒng)；離心機，最高轉(zhuǎn)速16 000 r/min。微量進樣器；1 000、200、20、10 μL（尖頭）各1支；電子天平。

1.3 標樣溶液的配制

稱取毒素蛋白標準品45.00 mg（精確至0.01 mg）于10 mL離心管中，加5 mL水，充分混勻。移取0.5 mL至1.5 mL EP管中，加入0.55 mol/L氫氧化鈉溶液0.125 mL，混勻，靜置5 min，再加入樣品稀釋液0.325 mL，總體積為0.95 mL，混勻后于沸水浴中煮6 min，冷卻至室溫，7 000 r/min離心15 min，取上層清液，以備電泳上樣。

1.4 Bti試樣前處理

1.4.1 稱樣 稱取Bti試樣30 mg（精確至0.01 mg，根據(jù)試樣128 ku與65 ku毒素蛋白含量稱取適量試樣，使處理后試樣溶液中128 ku與65 ku毒素蛋白含量均在0.2～0.8 mg/mL）于1.5 mL離心管中。

1.4.2 干擾物質(zhì)的消除 加入1.3 mL 0.1 mol/L的磷酸緩沖液（pH 8.0），混勻，15 000 r/min離心2 min，棄去上層清液。再加入1.3 mL水，混勻，15 000 r/min離心2 min，棄去上層清液。

1.4.3 試樣處理 向收集到的菌泥中加入0.5 mL水，充分混勻，加入0.125 mL 0.55 mol/L氫氧化鈉溶液，混勻，靜置5 min。再加入樣品稀釋液0.325 mL，混勻。于沸水浴中煮6 min，冷卻至室溫，7 000 r/min離心15 min，取上層清液，以備電泳上樣。

1.5 SDS-PAGE電泳

1.5.1 聚丙烯酰胺凝膠制備 按表1配方分別配制分離膠與濃縮膠。先配制分離膠，最后加入適量TMED（室溫高，TMED可適量減少，確保膠凝固時間在30～40 min），混勻后迅速倒入灌膠模具中，液面距凹槽玻璃板頂端3 cm左右，然后輕輕加入1 mL水至膠液面，注意不要擾亂液面。待膠凝固后，倒出水，用濾紙條吸干殘余水。將表1配制的濃縮膠混勻后迅速倒入分離膠上面，液面至凹槽玻璃板頂端，迅速插上10孔樣品梳。

1.5.2 進樣 將凝膠模具放入電泳槽中，打開凝膠模具下方密封口，并向陰、陽兩極槽注入適量pH 8.3電極緩沖液，陰極槽加滿，陽極槽中電極緩沖液沒過電泳模具下封口即可。小心取出凝膠中的梳子，用10 μL尖頭微量進樣器分別吸取10、8、6、4、2 μL上述標樣溶液上清液注入到不同的進樣孔中，再吸取6 μL試樣溶液上清液注入到試樣進樣孔中。蓋上電泳槽蓋，接通電源。

1.5.3 電泳 調(diào)節(jié)電泳儀電源電壓至100 V、電流50 mA。待溴酚藍指示劑前沿離開濃縮膠，進入分離膠后，調(diào)節(jié)電泳儀電源電壓至120 V。待溴酚藍指示劑前沿距膠邊1 cm左右時停止電泳。取出膠片，用樣品梳刀切去濃縮膠，小心將分離膠剝離至玻璃培養(yǎng)皿中。

1.5.4 固定 用7.5%乙酸將電泳后的分離膠片浸泡30 min以上。

1.5.5 染色 用考馬斯亮藍染色液染色4 h以上。

1.5.6 漂洗、脫色 先用漂洗液漂洗20 min左右，再用脫色液脫色至背景清晰為止。

1.6 成像及數(shù)據(jù)處理

1.6.1 凝膠成像 膠片經(jīng)脫色處理后，用電泳凝膠成像系統(tǒng)將凝膠成像，并將圖像文件保存于電腦。

1.6.2 數(shù)據(jù)處理 用Labscan 5.0軟件對蛋白帶進行圖像分析。毒素蛋白標準品中130 ku毒素蛋白含量為11.7%，標樣溶液進樣量為10、8、6、4、2 μL，根據(jù)標準品稱樣量與處理后最終體積計算出進樣毒素蛋白質(zhì)量依次為5.54、4.43、3.32、2.22、1.11 μg。以標樣溶液130 ku進樣毒素蛋白質(zhì)量為橫坐標，相應(yīng)的蛋白帶強度值為縱坐標，用最小二乘法作回歸方程，得到標準曲線y=ax+b。軟件自動按試樣溶液蛋白帶強度值計算出進樣試樣中128 ku與65 ku毒素蛋白的質(zhì)量。試樣中兩種主要分子量（128、65 ku）毒素蛋白質(zhì)量分數(shù)W，按以下公式計算。

式中，m為稱取試樣質(zhì)量，mg；V1為注入凝膠上樣孔的試樣溶液體積，μL；m1為從標準曲線上查得的試樣溶液中毒素蛋白的質(zhì)量，μg；V2為試樣最終定容體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bti試樣預(yù)處理

Bti試樣中存在一些培養(yǎng)基殘余物，有些物質(zhì)阻止了毒素蛋白與SDS形成毒素蛋白-SDS復(fù)合物，導(dǎo)致無法準確檢測出試樣中的毒素蛋白含量。采用表2的方法對Bti原粉（批號20170214）進行不同的預(yù)處理，預(yù)處理后15 000 r/min離心2 min，棄去上層清液，收集菌泥。然后參照Bt 1600WP HG3617-1999標準中毒素蛋白檢測方法檢測收集到的菌泥或菌粉毒素蛋白含量。不同預(yù)處理方法處理試樣后電泳見圖1，檢測結(jié)果見表2。由表2可知，針對同一批Bti原粉，不同的稱樣質(zhì)量，試樣不作預(yù)處理，按照Bt 16 000 IU/mg WP標準HG3617-1999中毒素蛋白檢測方法檢測其毒素蛋白含量，結(jié)果無法準確定量，甚至不出現(xiàn)特征蛋白帶現(xiàn)象；針對同一批Bti原粉，水洗前后比較，水洗后檢測結(jié)果升高，水洗1次與多次結(jié)果相近；用0.1 mol/L磷酸緩沖液及水洗滌試樣，結(jié)果高于用0.1 mol/L HCl與水洗滌試樣，且膠片脫色后背景清晰。

用1.3 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液洗試樣1次，15 000 r/min離心2 min，棄去上層清液，然后用水洗試樣1次，15 000 r/min離心2 min，棄去上層清液，收集菌泥。該方法基本可消除試樣中的一些殘余物質(zhì)對毒素蛋白定量檢測的干擾。

2.2 線性關(guān)系考察

稱取不同質(zhì)量的Bti原粉（批號20170214，128 ku毒素蛋白含量為2.25%，65 ku毒素蛋白含量為1.65%），按上述方法七對試樣進行預(yù)處理，電泳結(jié)果見圖2、表3。128 ku晶體蛋白-蛋白帶強度回歸方程見圖3，65 ku晶體蛋白-蛋白帶強度回歸方程見圖4。運用該方法對Bti試樣處理后，試樣稱樣量在10～50 mg（進樣晶體蛋白質(zhì)量在1.0～5.0 μg），進樣、電泳、脫色處理后，膠片中128 ku毒素蛋白質(zhì)量與其蛋白帶強度的回歸方程為y=1 460.5x+690.21，R2為0.995 6；65 ku毒素蛋白質(zhì)量與其蛋白帶強度的回歸方程為y=1 408.5x+1 002.2，R2為0.993 9。兩種主要晶體蛋白質(zhì)量與相應(yīng)的蛋白帶強度線性關(guān)系良好，符合方法線性關(guān)系要求。

2.3 方法重復(fù)性

分同時同一塊膠與不同時間不同膠分別考察該方法的重復(fù)性。稱取不同質(zhì)量的試樣Bti原粉（批號20170215），檢測其毒素蛋白含量，檢測結(jié)果見表4。由表4可知，128 ku毒素蛋白含量平均值為1.64%，變異系數(shù)2.67%；65 ku毒素蛋白含量平均值2.19%，變異系數(shù)2.21%；不同時間檢測Bti原粉兩種主要晶體蛋白含量，相對誤差可以控制在平均值的5%以內(nèi)。

2.4 殺蟲蛋白與生物效價相關(guān)性考察

以4齡庫蚊幼蟲為靶標昆蟲，以Bti IPS82（1 884菌株）為標準品，毒力效價為15 000 ITU/mg，分別稱取適量標準品與Bti試樣，用水稀釋得到6個稀釋濃度分別為0.06、0.05、0.04、0.03、0.02和0.01 mg/L的感染液，每種感染液為150 mL。向不同濃度的標樣溶液與試樣溶液各放入25×2頭4齡庫蚊幼蟲。所有試蚊在（25±2） ℃的溫度下飼養(yǎng)24 h后檢查死亡情況。計算標樣和試樣各濃度供試蚊死亡率，以水作空白對照，對死亡率進行校正。校正死亡率（X1）計算公式如下。

將感染液各濃度值換算成常用對數(shù)值，校正死亡率轉(zhuǎn)換成死亡幾率值，用最小二乘法作回歸方程，根據(jù)回歸方程分別求出標樣LC50值和待測試樣LC50值。待測試樣的毒力效價（X2）計算公式如下。

對近期生產(chǎn)的60批Bti原粉分別進行毒素蛋白（128 ku與65 ku）含量與生物效價（Culex）測定，將Bti原粉生物效價與毒素蛋白（128 ku+65 ku）含量數(shù)據(jù)繪制成散點圖（圖5）。散點圖中數(shù)據(jù)分布顯示出生物效價與毒素蛋白有一定的相關(guān)性。進一步運用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行雙變量相關(guān)性分析，結(jié)果顯示生物效價與毒素蛋白含量在0.01水平（雙側(cè)）上顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.569。

3 討論

隨著經(jīng)濟與社會發(fā)展，人們對環(huán)境保護的需求越來越高，采用環(huán)境安全的殺蟲劑進行害蟲控制已經(jīng)成為生產(chǎn)生活中的重要選擇。蘇云金芽孢桿菌（Bt）類是一種對多種農(nóng)業(yè)害蟲具有毒殺作用的微生物殺蟲劑，具有殺蟲高效、對人類和其他生物安全的特點[20]。蘇云金芽孢桿菌以色列亞種（Bti）藥劑主要以庫蚊幼蟲或伊蚊幼蟲作為靶標昆蟲檢測其毒力效價，因其個體差異大、受外界環(huán)境影響大等多方面原因?qū)е律餀z測誤差大、耗時長[13]。因此在相關(guān)產(chǎn)品的生產(chǎn)與應(yīng)用過程中需要更可靠的質(zhì)量檢測技術(shù)，來控制生產(chǎn)與貯存過程中的產(chǎn)品質(zhì)量。蘇云金芽孢桿菌類藥劑生物效價效用物質(zhì)有殺蟲蛋白形成的伴孢晶體、蘇云金素、芽孢、腸毒素、雙效菌素（ZwA）等，其中起主要作用的是伴孢晶體[21，22]。因此，本研究對Bti產(chǎn)品中伴孢晶體蛋白含量進行檢測，并分析其與產(chǎn)品生物效價的相關(guān)性，可以為進一步制定基于殺蟲蛋白含量的產(chǎn)品質(zhì)量控制檢測技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

中國國標和化工部標準中對Bt產(chǎn)品中毒素蛋白的定量檢測有明確闡述，但是在前期生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)按照Bt 16 000 IU/mg可濕性粉劑標準（HG 3617-1999）中毒素蛋白檢測方法難以檢測Bti殺幼蚊產(chǎn)品的殺蟲蛋白含量，推測由于Bti產(chǎn)品發(fā)酵采用培養(yǎng)基與該標準所涉及產(chǎn)品不同，產(chǎn)品中培養(yǎng)基殘留成分對蛋白質(zhì)電泳產(chǎn)生了影響。因此本研究以Bt 16 000 IU/mg可濕性粉劑標準（HG 3617-1999）中毒素蛋白檢測方法為基礎(chǔ)，針對Bti殺幼蚊產(chǎn)品進行方法改進，解決晶體蛋白難以檢測的問題。利用改進的方法，可以通過SDS-PAGE凝膠準確測定產(chǎn)品中兩種主要晶體蛋白（128 ku、65 ku）含量，并且定量結(jié)果與殺蟲效價有顯著相關(guān)性。

本研究針對Bti產(chǎn)品改進的晶體蛋白檢測定量技術(shù)，不僅可以從生物效價與晶體蛋白兩方面檢測Bti類產(chǎn)品的品質(zhì)，指導(dǎo)Bti類產(chǎn)品的生產(chǎn)過程管理，更好地控制Bti類產(chǎn)品的質(zhì)量，還可為進一步制定Bti類生物農(nóng)藥質(zhì)量標準提供技術(shù)參考。

參考文獻：

[1] 陸寶麟.我國瘧疾及其防治問題[J].中華流行病學(xué)雜志，1982（3）：279.

[2] 王逸民，葛繼乾，梁雪嘉，等.北京地區(qū)三帶喙庫蚊乙型腦炎感染率調(diào)查[J].中華流行病學(xué)雜志，1983（4）：273.

[3] 衛(wèi)生部瘧疾專家咨詢委員會.一九九七年全國瘧疾形勢[J].中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，1998（16）：161.

[4] 張國才，董學(xué)書，王學(xué)忠，等.騰沖縣昆明按蚊的分布及傳瘧作用調(diào)查[J].中國寄生蟲病防治雜志，1989（2）：206.

[5] 徐淑惠.中國絲蟲病防治[J].中國寄生蟲病防治雜志，1997（10）：246.

[6] WORLD HEALTH ORGANIZATION. Geographical Distribution of Arthropod-borne Diseases and Their Principal Vectors[M].Switzerland Geneva：Division of Vector Biology and Control，1989.

[7] 陸寶麟.中國登革熱媒介及其防治[M].貴陽：貴州人民出版社，1990.

[8] IBARRA J E，F(xiàn)EDERICI B A J. Isolation of arelatively toxic 65-kDa protein inclution from the parasporal body of Bacillus thuringiensis subsp. iraelensis[J].Bacteriology，1986，165（2）：527-533.

[9] 蒲蟄龍.蘇云金芽孢桿菌以色列變種防治蚊幼蟲的研究[M].廣州：中山大學(xué)出版社，1983.

[10] 吳繼星.細菌生物防治蚊子的研究進展[J].微生物學(xué)研究與應(yīng)用，1993（1）：27-30.

[11] 吳秋雁.蚊幼蟲感染蘇云金桿菌以色列變種后的病理研究[J].昆蟲學(xué)報，1986，29（1）：35-40.

[12] 宋金柱，楊 謙，趙 敏.蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白基因的研究進展[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，33（1）：66-67.

[13] 朱曉陽，閆建平，蔡全信，等.蘇云金芽孢桿菌以色列亞種殺蚊幼晶體蛋白的定量分析[A].全國殺蟲微生物學(xué)術(shù)研討會暨湖北省暨武漢市微生物學(xué)會和內(nèi)蒙古微生物學(xué)會[C].武漢：中國微生物學(xué)會，2008.

[14] SAMBROOK G L，F(xiàn)RITSCH E F，MANIATIS T，et al. Molecular Cloning[M].Beijing：Science Publishing House，1992.

[15] PIMENTEL D. Environmental and economic effects of reducing pesticide use[J].Bioscience，1991，41：402-409.

[16] 雷 萍，張金松，周 令，等.蘇云金芽孢桿菌以色列亞種對花翅搖蚊作用特性研究[J].微生物學(xué)通報，2004（1）：17-21.

[17] 劉麗君，張金松，雷 萍，等.蘇云金芽孢桿菌以色列亞種對搖蚊幼蟲毒力的生物測定方法[A].第八次全國環(huán)境微生物學(xué)術(shù)研討會論文集[C].哈爾濱：中國微生物學(xué)會，2006.

[18] 史琦琪，程 鵬，王海防，等.蘇云金桿菌對微山湖濕地中華按蚊幼蟲的室內(nèi)生測效果[J].中華衛(wèi)生殺蟲藥械，2017（3）：227-229.

[19] 馬素媛，王 英，趙 清，等.Bti對三帶喙庫蚊的殺傷效果及溫度的影響[J].中國熱帶醫(yī)學(xué)，2012（12）：1427-1429.

[20] 劉 剛.湖南師大“蘇云金芽孢桿菌殺蟲伴孢晶體蛋白質(zhì)組學(xué)研究”取得重要成果[J].農(nóng)藥市場信息，2009（12）：36.

[21] 王利平，代林遠，李 鵬.蘇云金芽孢桿菌研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2011，38（9）：224-227.

[22] 關(guān) 雄.蘇云金芽孢桿菌的研究回顧與展望[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2006，8（6）：5-11.