RNA干擾技術(shù)及其應(yīng)用

(聊城大學(xué) 山東 聊城 252000)

一、RNA干擾的發(fā)現(xiàn)

Rich Jorgensen在1990年研究轉(zhuǎn)基因矮牽牛如何改變花色的時(shí)候發(fā)現(xiàn)了一個(gè)現(xiàn)象：當(dāng)導(dǎo)人色素外源基因時(shí)并沒有產(chǎn)生預(yù)期設(shè)想的花色加深，反而出現(xiàn)花色斑駁。Rich Jorgensen考慮出現(xiàn)這個(gè)現(xiàn)象的原因是某些色素的缺失所致。這就提示，導(dǎo)入的基因和牽?；▋?nèi)源的著色基因都被抑制，也正因?yàn)槿绱?，?dāng)時(shí)把這種現(xiàn)象稱“共抑制[1]”(CO-suppression)。相似的現(xiàn)象也在線蟲中發(fā)現(xiàn)，稱為“靜息作用”(quelling)。1995年，康乃爾大學(xué)的Guo[2]等曾經(jīng)嘗試用反義RNA去阻斷線蟲的par-1基因表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)反義RNA的確能阻斷目的基因的表達(dá)，但作為對(duì)照的正義RNA，雖不能與活性RNA結(jié)合，也照樣能引發(fā)抑制。1998年，F(xiàn)ire[3]和Tabara首次將雙鏈RNA(double-strandRNA，dsRNA)正義鏈與反義鏈的混合物注入線蟲，結(jié)果表現(xiàn)出比單獨(dú)注入單鏈要強(qiáng)得多的沉默，并且導(dǎo)致子一代同源基因的沉默，這也是人們第一次應(yīng)用RNAi技術(shù)。事實(shí)上，即使每個(gè)細(xì)胞只注入幾個(gè)分子的dsRNA也足以引起抑制。隨后Hammond還發(fā)現(xiàn)，不僅在線蟲中，在果蠅中也存在dsRNA誘導(dǎo)的基因沉默，而且在它們的后代中依然表現(xiàn)沉默，并將這種現(xiàn)象稱為RNAi。這種雙鏈RNA導(dǎo)致的RNA干擾現(xiàn)象隨后在昆蟲、錐蟲、果蠅、渦蟲、斑馬魚、真菌、植物擬南芥等生物及哺乳動(dòng)物細(xì)胞株中也分別被發(fā)現(xiàn)。2001年Elbashir等[4]用siRNA率先在哺乳動(dòng)物培養(yǎng)的細(xì)胞中誘導(dǎo)特異性基因沉默，從而開始了RNAi技術(shù)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的研究應(yīng)用。2002年，Brummelkamp等首次成功構(gòu)建了小發(fā)夾RNA表達(dá)載體，并發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染該載體可特異性、有效地降低目的基因表達(dá)，為RNAi技術(shù)在基因治療中的應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)[5]。

二、RNA干擾的作用機(jī)制

RNAi是雙鏈介導(dǎo)的序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。作用過程可以分為啟動(dòng)階段、效應(yīng)階段、擴(kuò)增和擴(kuò)散階段四個(gè)階段。

啟動(dòng)階段：指dsRNA進(jìn)人細(xì)胞后，被Dicer酶特異性識(shí)別，以一種ATP依賴的方式裂解成21-23個(gè)核苷酸的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)。效應(yīng)階段：這一階段是指siRNA雙鏈與Dicer酶的雙鏈RNA結(jié)合成RNA對(duì)沉默復(fù)合物進(jìn)行誘導(dǎo)。當(dāng)沉默復(fù)合物被激活后，通過解螺旋酶的作用將核苷酸的小干擾RNA的雙鏈分開，隨后在特異的位點(diǎn)切割目的基因mRNA，最終降解目的基因mRNA。擴(kuò)增、擴(kuò)散階段：這一階段是指核苷酸的小干擾RNA的反義鏈與目的mRNA結(jié)合會(huì)激活RNA依賴的RNA聚合酶介導(dǎo)的單鏈RNA的合成，導(dǎo)致雙鏈RNA大量產(chǎn)生，而這些雙鏈RNA雙被切割成許多小干擾RNA，這些小干擾RNA被循環(huán)利用，因此，只需少量的雙鏈RNA就能誘發(fā)整個(gè)生物體的基因沉默[6-9]。這是RNAi經(jīng)典的在基因轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮作用的機(jī)制。近年來，大量研究證明，在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平上也存在RNAi現(xiàn)象。在轉(zhuǎn)錄水平，siRNA可以直接與其互補(bǔ)的DNA序列結(jié)合，這樣可以提高該DNA的甲基化水平，進(jìn)而阻止靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。而在蛋白水平上，RNAi現(xiàn)象則是由另一類長19-21個(gè)核苷酸的小分子RNA，即具有單鏈結(jié)構(gòu)的microRNA(miRNA)發(fā)揮作用。首先，細(xì)胞核中的miRNA基因的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物pri-miRNA被RNase III Drosha酶識(shí)別、結(jié)合并切割，產(chǎn)生miRNA前體即pre-miRNA經(jīng)過初步的剪切后，pre-miRNA進(jìn)入胞質(zhì)。由另一種RNase III Dicer酶識(shí)別并進(jìn)一步切割成類似siRNA的成熟miRNA，該miRNA能指導(dǎo)RISC復(fù)合物的組裝，使其結(jié)合目標(biāo)mRNA的3’端非翻譯區(qū)，從而引起靶基因的降解或翻譯抑制miRNA的前體加工還存在不依賴Dicer的其他途徑，也可以達(dá)到沉默基因的功能。

三、RNAi的特點(diǎn)

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是生物基因組抵抗病毒或轉(zhuǎn)座子之類的外來遺傳元件入侵的一種保護(hù)性機(jī)制，RNAi具有4個(gè)重要特征：(1)高效性：少量的雙鏈RNA(dsRNA)就可以使相應(yīng)的基因表達(dá)受到抑制，即其發(fā)生過程中有正反饋的信號(hào)放大效應(yīng)；(2)高特異性：雙鏈RNA(dsRNA)可以特異地降解與之序列相對(duì)應(yīng)的單個(gè)內(nèi)源基因的mRNA無關(guān)基因不受影響；(3)可遺傳性及遠(yuǎn)距離效應(yīng)：RNAi基因表達(dá)的效應(yīng)不僅能夠傳遞給子一代,而且可以在同一個(gè)生物體的不同細(xì)胞甚至生物體間進(jìn)行長距離的傳遞和維持；(4)ATP依賴性：RISC的形成和Dicer酶切割dsRNA的過程中都需要ATP的參與；因此,RNA干擾想要發(fā)生效應(yīng)則必須要依賴ATP的參與。此外，RNA干擾技術(shù)與傳統(tǒng)的技術(shù)相比，難度低，費(fèi)用低，試驗(yàn)周期較短，操作簡單，效果明顯，且RNA干擾還有對(duì)mRNA的切割位點(diǎn)確定性高、對(duì)細(xì)胞調(diào)控系統(tǒng)無影響，作用快速等特點(diǎn)。

四、RNAi技術(shù)的應(yīng)用

(一)功能基因組的研究

在功能基因組研究中，需要對(duì)特定基因進(jìn)行敲除，以確定其功能。由于幾乎所有包含已知基因編碼序列的dsRNA都能在體外特異性抑制該基因的功能，產(chǎn)生類似基因敲除的效果。因此RNAi已作為一種新型的反向遺傳學(xué)技術(shù)，成為功能基因組研究的重要工具。它與傳統(tǒng)的基因剔除技術(shù)相比具有投入少、周期短、操作簡單等優(yōu)勢。在基因的研究中，首先利用此技術(shù)剔除待研究的目標(biāo)基因，然后通過細(xì)胞表型改變的觀察、免疫蛋白印跡、免疫熒光等方法對(duì)基因的表達(dá)及功能進(jìn)行分析。迄今為止，RNA干擾技術(shù)在真菌、植物、線蟲、果蠅及哺乳動(dòng)物的基因功能研究中發(fā)揮了重要作用。

(二)疾病治療方面的應(yīng)用

1.抗病毒治療的應(yīng)用

(1)Jacque等針對(duì)HIV-1基因的不同區(qū)域，將人工合成的各種21個(gè)核苷酸siRNA或表達(dá)siRNA的質(zhì)粒與HIV-1共轉(zhuǎn)染CD4的HeLa細(xì)胞后，能特異性地降解HIV-1基因組RNA，從而干擾了HIV復(fù)制周期中的早期事件，防止了病毒反轉(zhuǎn)錄中間體的生成和前病毒確立。同樣的效果在原代培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞中也得到了實(shí)現(xiàn)[10]。Martinez等根據(jù)HIV-1進(jìn)入細(xì)胞需要趨化因子輔助受體CXCR4或CCR5的特點(diǎn)，特異地設(shè)計(jì)了針對(duì)該輔助受體的siRNA。siRNA轉(zhuǎn)染U87-CD4細(xì)胞后，不影響CD4的表達(dá)，但能有效抑制相應(yīng)的CxCR4或CCR5的表達(dá)。用X4(NIA-3)或R5(BaL)HIV-1株攻擊相應(yīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞能有效阻斷急性感染，并且抑制了HⅣ-1復(fù)制。siRNA的基因沉默功能已成為干擾HIV-1的新策略。

(2)脊髓灰質(zhì)炎病毒是一種快速復(fù)制、能高度溶解細(xì)胞的RNA病毒，Gidin等以此作為研究siRNA對(duì)病毒復(fù)制能力影響的模型[11]。他們?nèi)斯ず铣闪酸槍?duì)該病毒殼序列(SiC)和聚合酶序列(SiP)的siRNA，轉(zhuǎn)染HeLaS3和鼠成纖維細(xì)胞后進(jìn)行病毒攻擊。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞完全抑制了病毒噬菌斑的形成，抑制了病毒的復(fù)制，明顯減少了子代病毒的滴度，并能促進(jìn)絕大多數(shù)感染細(xì)胞清除病毒。通過對(duì)逃逸病毒的序列分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞所獲得的保護(hù)作用是siRNA針對(duì)病毒靶基因組起作用的直接結(jié)果，siRNA誘發(fā)了胞內(nèi)特異的抗病毒效應(yīng)。

(3)呼吸道合胞病毒(Rsv)是引起嬰幼兒病毒性下呼吸道感染最重要的病原體，為胞質(zhì)生活的單負(fù)鏈ILNA病毒。Bitko和Batik針對(duì)RSV基因組特定的基因，人工合成了序列特異的siRNA，轉(zhuǎn)染病毒感染的細(xì)胞后，能有效地降解病毒特定基因的mRNA，實(shí)現(xiàn)了對(duì)胞質(zhì)特定RNA基因的沉默。

2.遺傳病治療的應(yīng)用

美國西北大學(xué)的Carthew R W和日本基岡研究所的Ishizuka A等“發(fā)現(xiàn)RNAi同脆性x染色體綜合征(與FMR-1基因異常有關(guān)的導(dǎo)致智力低下的染色體病)之間的關(guān)系密切，揭示了與RNAi相關(guān)機(jī)制的缺陷可能導(dǎo)致人類疾病的病理機(jī)制。遺傳性疾病的RNAi治療成為當(dāng)今研究RNAi的又一大熱點(diǎn)。

3.腫瘤病治療的應(yīng)用

腫瘤是多個(gè)基因相互作用的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的結(jié)果。傳統(tǒng)技術(shù)誘發(fā)的單一癌基因的阻斷不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長。而RNAi可以利用同一基因家族的多個(gè)基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性。設(shè)計(jì)針對(duì)這一區(qū)段序列的dsRNA分子。只注射一種dsRNA即可以產(chǎn)生多個(gè)基因同時(shí)剔除的表現(xiàn)。也可以同時(shí)注射多種dsRNA而將多個(gè)序列不相關(guān)的基因同時(shí)剔除。Maen等應(yīng)用RNAi技術(shù)成功地阻斷了MCF7乳腺癌細(xì)胞中一種異常表達(dá)的與細(xì)胞增殖分化相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子基因Sp1的功能。

(三)RNAi與植物病毒病害研究

RNA干涉已被證實(shí)是一種特異、高效、經(jīng)濟(jì)的使基因表達(dá)受抑的技術(shù)手段。它可有效地將靶基因的表達(dá)水平降到一個(gè)低的水平，甚至于完全的清除。早于1985年，Sanford與Johnston二位學(xué)者就已經(jīng)提出”病原體衍生抗病性(pathogen derived resistance，PDR)”的觀念，證實(shí)將病毒基因轉(zhuǎn)入植物中可以使得植物產(chǎn)生對(duì)于該病毒的抗病性，其背后的分子機(jī)制即為RNAi。而后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)、煙草蝕刻病毒等病毒外鞘蛋白基因可用于轉(zhuǎn)殖植物而誘發(fā)對(duì)于該病毒的抗性，接著又發(fā)現(xiàn)其實(shí)不需要整個(gè)基因或完整蛋白的表達(dá)，僅需一部份的RNA序列也可以造成植物對(duì)于病毒的抗性，甚至可將多種病毒的RNA片段構(gòu)筑于同一載體，共同轉(zhuǎn)入植物中，即可造成該植物對(duì)于多種病毒的抗性。研究發(fā)現(xiàn)許多轉(zhuǎn)基因植物抗病毒的分子機(jī)制其實(shí)質(zhì)為RNAi的作用，并進(jìn)而發(fā)現(xiàn)RNAi的作用其實(shí)在動(dòng)物與植物多年的演化過程中，已成為對(duì)抗病原感染時(shí)的一種內(nèi)生性防御機(jī)制，同時(shí)亦在生物體生長、發(fā)育與分化的調(diào)控過程中，擔(dān)任重要的角色。將病毒在復(fù)制中起關(guān)鍵作用的基因作為目標(biāo)，設(shè)計(jì)dsRNA導(dǎo)入植株培育出抗病毒植株來抑制病毒的復(fù)制，培育抗病毒植株[12]。

除了抗病毒機(jī)制方面的研究，RNAi現(xiàn)象揭示了植物病毒引起植物病征表現(xiàn)如花葉、黃化、葉片卷曲、變形、植株矮化、叢生等的過程。目前已知寄主的病征表現(xiàn)與RNAi作用及其抑制息息相關(guān)。寄主植物通過RNAi機(jī)制造成病毒RNA的降解，而RNA病毒會(huì)演化出對(duì)抗RNAi作用的抑制物，而促進(jìn)病毒RNA的復(fù)制。近年來對(duì)RNAi的研究發(fā)現(xiàn)許多的RNA病毒基因體中都帶有RNAi的抑制物，這些病毒所攜帶的RNAi作用抑制物可抑制其寄主內(nèi)生性的RNAi作用，進(jìn)而造成寄主細(xì)胞生理或分化作用時(shí)的不正常，表現(xiàn)出卷葉、絲狀葉等畸形病征。

五、RNA干擾技術(shù)的展望

RNAi沉默機(jī)制的高效性、特異性及穩(wěn)定性使這項(xiàng)技術(shù)成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一次劃時(shí)代的革命。它的出現(xiàn)給基因功能研究、生物基因工程、醫(yī)藥研究提供了一種全新的方法?？傊琑NA干擾在各種基因沉默現(xiàn)象中的所起的巨大作用預(yù)示著RNA干擾技術(shù)將廣泛被用于各種領(lǐng)域。RNAi不但是研究基因功能的一種有用工具，而且為特異性基因治療提供了新的技術(shù)手段，RNA干擾技術(shù)具有巨大的科研價(jià)值和社會(huì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。雖然RNAi的分子機(jī)制已被初步了解，并較為成功地用于基因功能、疾病治療等研究方面。但仍有許多問題還需進(jìn)一步探索。