花生葉提取物對(duì)電子束輻照后脂肪酶活性的保護(hù)作用

陳龍祥，余國(guó)文

(中-莫農(nóng)業(yè)技術(shù)示范中心，馬普托 999068)

輻照技術(shù)是用γ射線、x射線、電子束等對(duì)食品進(jìn)行處理,以達(dá)到殺蟲、殺菌和抑制發(fā)芽等目的，從而提高食品的衛(wèi)生質(zhì)量、延長(zhǎng)食品(農(nóng)產(chǎn)品)貨架期等。有報(bào)道認(rèn)為，在酶活性中心存在關(guān)鍵性氨基酸[1]，如果其被破壞或被修飾，則酶活力喪失[2]。輻照可能改變酶結(jié)構(gòu)，包括空間結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、活性中心，促使蛋白質(zhì)發(fā)生一系列化學(xué)變化，分子完整的一級(jí)結(jié)構(gòu)遭到破壞，喪失生物活性[3]。也有報(bào)道認(rèn)為，輻照使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)和降解反應(yīng)，破壞白蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)[4]。

鱸魚(Lateolabraxjaponicus)，別名花鱸，分布于近海，河口海水淡水交匯處，是一種常見的名貴經(jīng)濟(jì)魚類。鱸魚具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，富含蛋白質(zhì)及各種微量元素[5]。植物多酚是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的具有多元酚結(jié)構(gòu)的次生代謝物[6]，主要存在于植物的皮、根、葉、果中。植物多酚中有多元?dú)滏I和大量疏水鍵[7]，能同蛋白質(zhì)等結(jié)合產(chǎn)生反應(yīng)，這是其最重要的化學(xué)特征。由于植物多酚提取技術(shù)的進(jìn)步，其已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)[8]。脂肪酶隸屬于羧基酯水解酶類，能夠逐步地將甘油三酯水解成甘油和脂肪酸并且作為一種輔助助劑，因而被大量地應(yīng)用到食品行業(yè)[9-10]。據(jù)報(bào)道，國(guó)外科研人員已經(jīng)從鯔魚[11]、沙丁魚[12]、鮭魚[13]中分離純化得到了脂肪酶，但是對(duì)鱸魚脂肪酶研究較少。研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚對(duì)白魚中不飽和脂肪酸的氧化或分解具有顯著的保護(hù)作用[14]。但花生葉多酚物質(zhì)對(duì)鱸魚脂肪酶是否具有保護(hù)作用是現(xiàn)階段亟需解決的課題。筆者研究不同劑量輻照對(duì)脂肪酶的影響，通過酶活力測(cè)定、蛋白質(zhì)凝膠電泳及生物質(zhì)譜鑒定，擬在理論上解決輻照對(duì)鱸魚脂肪酶的影響以及花生葉提取物質(zhì)對(duì)脂肪酶保護(hù)作用，并在實(shí)踐中指導(dǎo)花生葉多酚在輻照后鱸魚脂肪酶保護(hù)中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1材料鱸魚(購(gòu)于武漢市中百超市)、電子束源(能量為4.9 MeV、束流為2 mA，傳送速率為6 m/min)。

1.2試劑與儀器

1.2.1試劑。磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、蛋白磷酸酶抑制劑混合物P1260、對(duì)硝基苯酚、對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯、異丙醇、Tris、鹽酸、丙烯酰胺、過硫酸銨、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉、溴酚藍(lán)、巰基乙醇、磷酸、考馬斯亮藍(lán) G250、硫酸銨、甲醇、乙酸。

1.2.2儀器。MAXX電子天平(丹佛儀器北京有限公司)；LGJ-25C冷凍干燥機(jī)(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司)；Sartorious Talent分析天平 (賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；勻漿機(jī)(弗魯克流體機(jī)械制造有限公司)；UH-5300紫外可見光分光光度計(jì)(尤尼柯上海儀器有限公司)。

1.3方法

1.3.1脂肪酶樣品制備。 鱸魚洗凈，去除膽囊，取內(nèi)臟，按照1∶3比例加入磷酸鹽緩沖液(25 mmol/L緩沖液，含 150 mmol/L NaCl，蛋白磷酸酶抑制劑，pH調(diào)至6.5)，4 ℃勻漿機(jī)勻漿處理3次，每次15～18 s,低溫?cái)嚢?0 min，10 000 r/min離心30 min，取上清液，即為內(nèi)臟粗酶液。利用80%硫酸銨分級(jí)沉淀，沉淀過2 kDa 截留分子量的超濾管，沉淀冷凍干燥，-20 ℃保存[15-17]。

1.3.2蛋白質(zhì)含量測(cè)定。蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法按照Bradford法[18](試劑購(gòu)于聯(lián)科生物公司)。先將所有試劑(G250 染色液、BSA 溶液、樣品)平衡至室溫，然后取50 μL BSA 溶液(2 mg/mL)，用溶解蛋白樣品的緩沖液稀釋至200 μL，終濃度為0.5 mg/mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)置參考如下:標(biāo)準(zhǔn)品的用量分別為0、1、2、4、8、12、16和20 μL，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到20 μL。樣品孔中加入20 μL待測(cè)樣品。如樣品濃度過高，可適當(dāng)稀釋，使之落在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。后每孔加入200 μL G250染色液，室溫放置2～5 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD595，或560～610 nm的其他波長(zhǎng)的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中的蛋白濃度。

1.3.3酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線建立。參照Winkler法，并稍加改動(dòng)，采用人工底物對(duì)硝基丁酸酯與對(duì)硝基棕櫚酸酯，兩者被脂肪酶催化水解后會(huì)釋放黃色對(duì)硝基苯酚，在410 nm 處測(cè)吸收波長(zhǎng)，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.121 20x+0.028 67(R2=0.992 9)。

1.3.4酶活測(cè)定。參照Winkler法，并稍作改動(dòng)，稱取30 mg的 p-NPP(對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯)粉末溶于10 mL的異丙醇中，配成溶液A，用0.05 mol/L pH 8.0 的Tris-HCl緩沖液配制0.5%濃度的Tris-HCl溶液，配成溶液B，取溶液 A 100 μL 和溶液B 2.6 mL 混合均勻后，再加入1 mL 0.05 mol/L pH 8.0的Tris-HCl溶液，混合均勻，37 ℃穩(wěn)定2 min。在平行樣中加入50 μL的酶，37 ℃水浴反應(yīng) 15 min。在空白管內(nèi)加入50 μL已經(jīng)滅活的酶，并將所有的管放入-20 ℃5 min以終止反應(yīng)。在410 nm下用分光光度計(jì)測(cè)吸光值，并對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活[19]。

1.3.5脂肪酶樣品輻照劑量處理及SDS-PAGE。取3 g脂肪酶蛋白樣品，充分溶解于40 mL蒸餾水中，即為酶液。量取200 μL酶液，配制如下濃度混合物，分別為粗提物(0.22 g/mL)、石油醚相(0.17 g/mL)、氯仿相(0.167 g/mL)、乙酸乙酯相(0.24 g/mL)、水相(0.36 g/mL)，配制終濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 g/mL共8個(gè)濃度梯度，分別進(jìn)行0、1、2和3 kGy劑量輻照。樣品按常規(guī)SDS-PAGE電泳[20]，0.05%考馬斯亮藍(lán)G250染色。

1.3.6目標(biāo)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定。 將完成的膠片取出放在照膠機(jī)上，用直尺量出其溴酚藍(lán)線底端的距離，記錄下來，然后量出各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的遷移距離和魚脂肪酶的遷移距離，再使用相對(duì)遷移率公式，將各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白和魚脂肪酶的相對(duì)遷移率計(jì)算出來。

2 結(jié)果與分析

2.1不同輻照劑量對(duì)脂肪酶活力的影響由圖1A可知，不同劑量的電子束輻照脂肪酶對(duì)酶活性產(chǎn)生不同的影響。當(dāng)脂肪酶沒有進(jìn)行輻照時(shí)，酶活力是0.291 μmol/min；當(dāng)吸收劑量為1 kGy時(shí)，酶活力顯著提高，為0.333 μmol/min；當(dāng)吸收劑量為2 kGy時(shí)，酶分子可能發(fā)生了交聯(lián)反應(yīng)，條帶變深，出現(xiàn)了少量分子量略大于蛋白質(zhì)分子，酶活力是0.372 μmol/min。低劑量的輻照促進(jìn)了酶活力提高，而當(dāng)輻照劑量達(dá)3、4、5 kGy時(shí)，脂肪酶活力開始下降，可能是由于蛋白質(zhì)肽鏈發(fā)生了斷裂，蛋白質(zhì)發(fā)生降解，一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，酶活力降低(圖1B)。

注:A.0～5 kGy輻照時(shí)酶活；B.0～5 kGy輻照時(shí)SDS-PAGE情況Note:A.Enzyme activity in 0-5 kGy irradiation;B.SDS-PAGE in 0-5 kGy irradiation圖1 0～5 kGy輻照鱸魚脂肪酶酶活及SDS-PAGEFig.1 Lipase activity of Lateolabrax japonicus irradiated with 0-5 kGy and SDS-PAGE

2.2不同花生葉提取物對(duì)不同劑量輻照后脂肪酶活力的影響由圖2可知，粗提物對(duì)酶活力的促進(jìn)影響最大，并顯著大于其他相酶活力，氯仿相次之，石油醚相和水相酶活力保持較穩(wěn)定水平，而乙酸乙酯相酶活力波動(dòng)較大。據(jù)以上可以推測(cè)，植物多酚含有某種物質(zhì)，對(duì)脂肪酶活力起到了保護(hù)作用，隨著粗提物的逐層萃取分離，該物質(zhì)的含量也隨之降低。

2.3目標(biāo)蛋白相對(duì)遷移率蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量分?jǐn)?shù)的冪和其遷移率有著線性關(guān)系，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)lgMW為縱坐標(biāo)，相對(duì)遷移距離為橫坐標(biāo)做圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)。然后根據(jù)樣品蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移距離，從標(biāo)準(zhǔn)曲線所得方程求出其相對(duì)分子質(zhì)量。

蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：lgMW=K-bX，式中，MW為分子量，X為遷移率，K、b均為常數(shù)，測(cè)量目標(biāo)蛋白遷移距離是4.94 cm，帶入方程，即所得目標(biāo)蛋白大小為34.08 kDa。

注:A、B、C、D、E分別為粗提物相、石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、水相Note:A,B,C,D and E are crude extract phase,petroleum ether phase,chloroform phase,ethyl acetate phase and water phase respectively圖2 0～3 kGy條件下不同花生葉提取物對(duì)脂肪酶活力的保護(hù)作用Fig.2 Protective effects of different peanut leaf extracts on lipase activity under 0-3 kGy conditions

圖3 標(biāo)準(zhǔn)蛋白相對(duì)遷移率標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Relative mobility standard curve of standard protein

2.4不同劑量輻照對(duì)目標(biāo)蛋白的影響根據(jù)以上結(jié)果，與對(duì)照相比，在3 kGy電子束輻照時(shí)，花生葉提取物分別起到了不同的保護(hù)脂肪酶的作用，花生葉粗提物對(duì)脂肪酶的保護(hù)作用最強(qiáng)烈，并且隨著濃度的增加，保護(hù)作用增強(qiáng)，石油醚相作用也比較明顯，但不如粗提物相明顯，氯仿相在一定程度上也起到了保護(hù)作用，與前3個(gè)相對(duì)比，乙酸乙酯相和水相保護(hù)作用最弱(圖4)。由上可以推測(cè)，隨著花生葉提取物分級(jí)萃取，各個(gè)相含有脂肪酶有效保護(hù)物質(zhì)減少。

2.5脂肪酸結(jié)合酶促進(jìn)脂肪分解脂肪酸結(jié)合蛋白屬于脂結(jié)合蛋白超家族成員,是一類分子量較小而對(duì)脂肪酸有高親和力的可溶性蛋白質(zhì)[21]，廣泛存在于脊椎動(dòng)物和非脊椎動(dòng)物的細(xì)胞質(zhì)中。它是細(xì)胞內(nèi)重要的脂肪酸載體蛋白,廣泛參與脂肪酸的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝[22]。最基本的功能主要是參與脂肪酸從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)到脂肪酸在細(xì)胞內(nèi)被利用的位置。脂肪酸通過各種細(xì)胞質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)一般認(rèn)為是簡(jiǎn)單擴(kuò)散和脂類分離的被動(dòng)過程,這種轉(zhuǎn)運(yùn)隨之就結(jié)合到細(xì)胞質(zhì)上,然后運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞器里,或者沿著細(xì)胞內(nèi)膜繼續(xù)移動(dòng)[23]。目前長(zhǎng)鏈脂肪酸有2種轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制[24]，一是脂肪酸經(jīng)過被動(dòng)擴(kuò)散穿過細(xì)胞膜；二是在蛋白的參與下完成脂肪酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。這種轉(zhuǎn)運(yùn)隨之就結(jié)合到細(xì)胞質(zhì)上,然后運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞器里,或者沿著細(xì)胞內(nèi)膜繼續(xù)移動(dòng)。脂肪酸結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)脂肪酸代謝，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的濃度,調(diào)控多種細(xì)胞內(nèi)的生化反應(yīng)過程:可能影響脂類代謝的酶,還阻斷或逆轉(zhuǎn)脂肪酸及其酞基輔酶對(duì)其他酶及細(xì)胞膜的作用[25-26]。此外,在長(zhǎng)鏈脂肪酸的攝入以及維持機(jī)體代謝內(nèi)環(huán)境平衡中的重要作用已經(jīng)通過基因破壞試驗(yàn)得到證明。因此，花生葉提取物在脂肪酸結(jié)合蛋白生化過程中，對(duì)β氧化起到了很好的保護(hù)作用，從而很好地保護(hù)了脂肪酸。圖5是脂肪酸結(jié)合蛋白代謝過程。

注:A為對(duì)照；B、C、D、E、F為添加不同濃度的粗提物相、石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、水相Note:A is the control；B,C,D,E，F(xiàn) and F are crude extract phase,petroleum ether phase,chloroform phase,ethyl acetate phase and water phase with different concentrations圖4 3 kGy條件下不同花生葉提取物SDS-PAGE驗(yàn)證Fig.4 SDS-PAGE validation of different peanut leaf extracts under 3 kGy condition

圖5 脂肪酸結(jié)合蛋白代謝 Fig.5 Fatty acid binding protein participates in the adipose catabolism

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，電子束輻照脂肪酶后，能在一定范圍內(nèi)對(duì)酶活性起到促進(jìn)作用，其中在2 kGy輻照時(shí)促進(jìn)作用最為明顯。提取花生葉不同萃取物，在不同劑量輻照下可以發(fā)現(xiàn)，粗提物相對(duì)酶活性保護(hù)作用最為明顯，其次為氯仿相、石油醚相。保護(hù)作用最差的為乙酸乙酯相和水相。進(jìn)一步通過SDS-PAGE驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，在3 kGy輻照情況下，與對(duì)照相比，粗提物相保護(hù)脂肪酶效果最為明顯，其次為氯仿相、石油醚相。保護(hù)作用最差的為乙酸乙酯相和水相，以上處理都是隨著提取物濃度的增加，保護(hù)作用增加，再一次驗(yàn)證了酶活試驗(yàn)。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，心型和腦型脂肪酸結(jié)合蛋白占比超過50%，集中在線粒體以及過氧化為酶體β氧化過程。綜上所述，花生葉提取物，能間接保護(hù)鱸魚脂肪酶，防止其降解以及增加其酶活，這對(duì)于花生葉開發(fā)利用提供了很好的理論依據(jù)。