米非司酮對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜異位病灶中COX-2及VEGF表達(dá)的影響

南 燕，李玉潔

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南新鄉(xiāng) 453003)

子宮內(nèi)膜異位癥是一種常見的良性婦科病癥，以慢性盆腔痛、性交痛、不孕、月經(jīng)失調(diào)等為主要臨床表現(xiàn)，對(duì)生育期女性的健康造成嚴(yán)重不良影響，在不孕患者中發(fā)病率高達(dá)25%～50%[1]，但其作用機(jī)制尚未闡明，臨床治療難度較大，近些年來該病的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。目前臨床上治療子宮內(nèi)膜異位癥的方法多種多樣，但是只有徹底明確藥物治療的作用機(jī)制，才能保障用藥安全性和合理性。本研究選取造模成功的子宮內(nèi)膜異位癥大鼠作為研究對(duì)象，觀察不同劑量米非司酮對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥的療效，以及環(huán)氧合酶-2(COX-2)與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取8周齡健康雌性SD大鼠,體質(zhì)量200～220 g，由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，在室溫18～26 ℃、相對(duì)濕度40%～70%的環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng)，自由飲水、飲食。通過陰道脫落細(xì)胞檢查確認(rèn)均為處于發(fā)情期的性成熟大鼠。

1.2方法

1.2.1造模及分組 用10%水合氯醛給予SD大鼠腹腔注射麻醉，在腹部正中做長約2 cm的縱行切口。分離大鼠子宮，切斷中部的一段子宮，兩端結(jié)扎。然后將管狀子宮剪切成兩塊子宮片段，大小均為5 mm×4 mm，其中一部分保存在-80 ℃冰箱凍存，另一部分縫合于腹部切口處腹肌與皮下筋膜層之間，常規(guī)關(guān)腹。術(shù)后每天觀察腹部切口及包塊情況，4周后再次開腹，可見移植病灶體積明顯增大，并有液體積聚的透明小泡，囊壁表面有新生血管形成，HE染色顯微鏡下觀察可見腺體及間質(zhì)細(xì)胞，說明造模成功[2]。建模成功的112只大鼠分為對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組28只。

1.2.2藥物及劑量 采用米非司酮原藥粉，由浙江仙琚制藥公司提供。低、中、高劑量分別對(duì)應(yīng)臨床用藥 10、12.5、25 mg/d，根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)藥物換算公式：大鼠用藥劑量=(用藥劑量/60 kg)×大鼠體質(zhì)量(kg)×6.25，進(jìn)行計(jì)算后得出低劑量組給藥劑量為1.041 mg·kg-1·d-1，中劑量組給藥劑量為1.24 mg·kg-1·d-1，高劑量組給藥劑量為2.604 mg·kg-1·d-1。將米非司酮原藥粉與花生油進(jìn)行融合，形成 1 mg/mL 混懸液后灌胃，對(duì)照組僅給予1 mL花生油灌胃。

1.2.3觀察指標(biāo)

1.2.3.1異位內(nèi)膜病灶體積變化 建模成功后用游標(biāo)卡尺測(cè)量異位囊腫的長、寬、高，根據(jù)公式V=0.52×長×寬×高[3]，計(jì)算體積 V1。灌胃治療4周后，再次剖腹測(cè)量并計(jì)算異位囊腫的體積V2，處死大鼠取異位病灶組織，放入-80 ℃凍存。

1.2.3.2RT-PCR法檢測(cè)COX-2、VEGF的表達(dá)水平 Trizol裂解細(xì)胞，檢測(cè)并計(jì)算出RNA的濃度和純度，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR，條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸7 min，4 ℃保存。COX-2上游引物:5′-AGA AGT TGA TAA TCG GGT AGT C-3′，下游引物:5′-CCT AGT GAA GGA TGG GTC-3′;VEGF上游引物:5′-ATC TTC AAG CCG TCC TGT GTG-3′，下游引物:5′-TTC TCC GCT CTG AAC AAG GC-3′;GAPDH上游引物:5′-GGC AAG TTC AAG GCA CAG-3′，下游引物:5′-GCC AGT AGA CTC CAC GAC AT-3′。采用2-ΔΔCt法計(jì)算出 COX-2、VEGF mRNA表達(dá)[4]。

2 結(jié) 果

2.1造模前后兩種內(nèi)膜組織中COX-2、VEGF mRNA的表達(dá)情況 造模成功后大鼠腹壁異位內(nèi)膜組織中COX-2 mRNA、VEGF mRNA的表達(dá)水平較造模前在位內(nèi)膜組織明顯升高(P<0.05)，見表1。

表1 造模前后不同內(nèi)膜組織中COX-2、VEGF mRNA表達(dá)比較

2.2各組大鼠異位內(nèi)膜病灶體積變化 治療后，與對(duì)照組比較，其他3組異位內(nèi)膜病灶體積明顯縮小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；米非司酮各治療組治療后較治療前均有縮小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠異位內(nèi)膜病灶體積變化

a:P<0.05，與對(duì)照組比較；b:P<0.05，與低劑量組比較；c:P<0.05，與中劑量組比較

表3 各組大鼠內(nèi)膜異位組織中COX-2、VEGF mRNA表達(dá)

a:P<0.05，與對(duì)照組比較；b:P<0.05，與低劑量組比較；c:P<0.05，與中劑量組比較

2.3各組大鼠COX-2、VEGF mRNA表達(dá)情況 不同劑量米非司酮治療組COX-2、VEGF mRNA表達(dá)水平均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨劑量增加呈下降趨勢(shì)(P<0.05)，見表3、圖1。

圖1 各組異位內(nèi)膜組織中COX-2、VEGF mRNA的表達(dá)

2.4Pearson相關(guān)性分析 COX-2 和VEGF 的表達(dá)具有明顯的相關(guān)性(r=0.782，P<0.05)。

3 討 論

子宮內(nèi)膜異位癥是一種激素依賴性疾病，其發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，可能與年齡、月經(jīng)周期、口服避孕藥等因素相關(guān)[5]，臨床表現(xiàn)主要有盆腔疼痛、月經(jīng)紊亂及不孕等，且存在惡變的可能[6]。根據(jù)患者病情嚴(yán)重程度、年齡、有無生育要求及意愿等可選擇手術(shù)、藥物及手術(shù)聯(lián)合藥物治療等方法。目前臨床上常用的藥物有來曲唑、高效孕激素、促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑等[7]，但這些藥物均有明顯不良反應(yīng)。

米非司酮可拮抗雌、孕激素，以及下調(diào)其受體，影響體內(nèi)多種細(xì)胞因子的代謝和產(chǎn)生，如黏附分子、抗侵襲因子、抗血管生成因子等。自KETTLE等于1991年首次將米非司酮用于臨床治療子宮內(nèi)膜異位癥，已有20多年，但其作用機(jī)制尚不明確，也無推薦的使用劑量?，F(xiàn)有的治方案中使用腹腔鏡與米非司酮聯(lián)合治療子宮內(nèi)膜異位癥，臨床療效好，復(fù)發(fā)率降低[8]。有研究證實(shí)雌激素能促進(jìn)COX-2表達(dá)，從而誘導(dǎo)PGE2 的產(chǎn)生，而米非司酮能通過其抗雌激素作用，干擾PGE2對(duì)異位子宮內(nèi)膜的刺激作用[2]。也有研究表明，米非司酮能使宮內(nèi)膜腺體及間質(zhì)中雄激素受體(AR)表達(dá)增加,通過高雄激素抑制雌激素的作用。LI 等[9]通過大鼠異位癥模型證實(shí)米非司酮能夠降低COX-2基因轉(zhuǎn)錄,使其蛋白表達(dá)下降，從而達(dá)到降低前列腺素分泌。BOUCHARD研究表明：米非司酮可以抑制異位內(nèi)膜病灶組織在腹腔中的植入及促進(jìn)凋亡[10]。

COX-2是一種膜結(jié)構(gòu)蛋白，能將花生四烯酸轉(zhuǎn)代謝成各種PG產(chǎn)物，多種生長因子、細(xì)胞因子、腫瘤啟動(dòng)因子、激素等可誘導(dǎo)COX-2產(chǎn)生。研究表明,COX-2可能和子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生、發(fā)展相關(guān),它參與了異位內(nèi)膜血管的生成。COX-2對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜高表達(dá)的機(jī)制如下：(1)雌激素可以直接或間接調(diào)節(jié)COX-2表達(dá)；(2)異位內(nèi)膜損傷可產(chǎn)生如IL-1和IL-2等多種細(xì)胞因子，能刺激COX-2的表達(dá)；(3)子宮內(nèi)膜異位癥是一種雌激素依賴性疾病，雌激素可以增加自身抗體合成，但后者能增加上皮細(xì)胞COX-2的表達(dá)。

血管形成是子宮內(nèi)膜異位癥致病和病情進(jìn)展的重要因素，VEGF可通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，促進(jìn)血管形成和生長[11-12]，作用尤為顯著。黎俊伶[13]研究證實(shí)，VEGF參與了新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂，促進(jìn)了新生血管的形成能力，與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病、進(jìn)展密切相關(guān)。秦江霞等[14]發(fā)現(xiàn)COX-2、VEGF、MVD在子宮內(nèi)膜異位癥中的高表達(dá)，與在子宮內(nèi)膜異位的血管生成有關(guān)。近期JANA等[15]發(fā)現(xiàn)MMP-2參與細(xì)胞遷移和侵入，可通過COX-2-PGE2-pAKT軸途徑促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥的血管生成。SUTRISNO等[16]發(fā)現(xiàn)COX-2可以使腫瘤細(xì)胞內(nèi)的VEGF表達(dá)上調(diào)，可能是通過一系列的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制調(diào)控了VEGF的表達(dá)，參與了血管的生成。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，造模前后在位子宮內(nèi)膜組織和異位子宮內(nèi)膜組織中COX-2、VEGF mRNA水平明顯升高。當(dāng)給予米非司酮干預(yù)后，子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠異位內(nèi)膜病灶面積明顯縮小，說明米非司酮能有效抑制異位內(nèi)膜的生長和侵襲，這與BOUCHARD研究結(jié)果一致。異位內(nèi)膜組織中COX-2、VEGF mRNA水平明顯降低，說明COX-2、VEGF與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，這些結(jié)果與秦江霞等的研究也相符。米非司酮對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠異位內(nèi)膜病灶的療效具有劑量依賴性，米非司酮可通過下調(diào)COX-2的水平減少VEGF的生成，從而控制異位病灶蔓延，這也證實(shí)了SUTRISNO等的推理。本實(shí)驗(yàn)證明較短周期的高劑量米非司酮對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥可取得較好臨床療效，而且米非司酮具有廉價(jià)、口服吸收快、生物利用度高、不良反應(yīng)少等優(yōu)勢(shì)，臨床應(yīng)用價(jià)值高。但長期大量使用后伴隨的藥物副反應(yīng)及藥物副反應(yīng)最低的理想治療劑量的選取仍需進(jìn)一步研究。本次實(shí)驗(yàn)樣本量較小，后期仍需大樣本量資料驗(yàn)證，期望為子宮內(nèi)膜異位癥的臨床治療提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)參考。