RVVC致病白假絲酵母菌對小鼠陰道上皮侵襲性及局部免疫的研究

姚福強(qiáng)，盧 偉，祁文瑾

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科，昆明 650032)

外陰陰道假絲酵母菌病(vulvovaginal candidiasis，VVC)是由假絲酵母菌引起的陰道黏膜和(或)外陰真菌感染，是婦產(chǎn)科常見的感染性疾病。研究顯示，VVC的發(fā)生與宿主防御機(jī)制及陰道上皮局部免疫功能變化相關(guān)[1-2]。上皮細(xì)胞在假絲酵母菌刺激下釋放多種免疫因子組成復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)，在局部免疫應(yīng)答中起著調(diào)控作用[3-4]。細(xì)胞介導(dǎo)免疫(cell-mediated immunity，CMI)是陰道局部免疫抵抗假絲酵母菌感染的主要防御機(jī)制，其中輔助性T(helper T，Th)細(xì)胞及其細(xì)胞因子等在抗假絲酵母菌感染中發(fā)揮了重要作用[5]。但其確切機(jī)制尚不明確，本研究在小鼠陰道上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的基礎(chǔ)上檢測陰道局部免疫因子表達(dá)與真菌侵襲力的關(guān)系，以期為RVVC的發(fā)病機(jī)制提供新理論。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1致病白假絲酵母菌 所有致病白假絲酵母菌均來自本院婦產(chǎn)科門診VVC、RVVC患者?；颊呔橥?，研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。VVC、RVVC診斷標(biāo)準(zhǔn)以第8版婦產(chǎn)科學(xué)為依據(jù)。排除妊娠期、哺乳期、患糖尿病，口服避孕藥，3個(gè)月內(nèi)接受過全身抗真菌治療或1個(gè)月內(nèi)接受過外用抗真菌藥物治療，患免疫性疾病或正在服用免疫抑制劑、混合陰道感染者。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 小鼠購自昆明醫(yī)科大學(xué)SPF動(dòng)物房，雌性，體質(zhì)量23～27 g，動(dòng)物合格證編號：SCXK(滇)K2015-0002。

1.1.3主要試劑 沙堡羅氏培養(yǎng)基(250 g，法國生物梅里埃公司)；EpiLife cf kit(500 mL，美國Gibico公司)；胎牛血清(500 mL，美國Gibico公司)；0.25%胰酶+0.02%EDTA(100 mL，美國HyClone公司)；中性蛋白酶Ⅱ(1 g，德國Sigma公司)；小鼠IL-8、TNF-α、IL-4 ELISA試劑盒(4 pack，美國Ebioscience公司)。

1.2方法

1.2.1小鼠陰道上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng) 斷頸法處死小鼠，消毒鋪巾解剖取出新鮮陰道上皮，用含雙抗的PBS清洗后放入含2 U/mL DispaseⅡ中并置于4 ℃冰箱過夜。分離上皮層分割成碎片，用2 mL 0.25%胰酶37 ℃消化15 min，含10%胎牛血清的DMEM/F12終止消化，輕輕吹打2 min吸出細(xì)胞懸液過濾，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。加EpiLife重懸計(jì)數(shù)，按每毫升1×106個(gè)細(xì)胞接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；48 h首次換液，以后隔天換液，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況。

1.2.2小鼠陰道上皮細(xì)胞傳代與鋪板、爬片制作 取生長匯合度90%的上皮細(xì)胞，1 mL 0.25%胰酶消化，等量含10%胎牛血清的DMEM/F12終止消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。加EpiLife重懸并計(jì)數(shù)，按每毫升1×105個(gè)細(xì)胞接種于明膠處理的24孔板，繼續(xù)培養(yǎng)；將明膠處理的爬片置于24孔板中，爬片中點(diǎn)上方加2滴細(xì)胞懸液，置于培養(yǎng)箱30 min，沿孔邊加入1 mL EpiLife，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3致病白假絲酵母菌菌液配置 選取VVC、RVVC致病菌株各6株，復(fù)溫后挑取單菌落在沙堡羅氏培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)種純化2次，挑取約1 mm單菌落加入1 mL EpiLife中，吹打混勻，計(jì)數(shù)調(diào)整密度為1×106CFU/mL。

1.2.4ELISA檢測IL-4、IL-8、TNF-α水平 鋪板24 h，換液。實(shí)驗(yàn)組加1 mL EpiLife及致病菌懸液各1 mL與上皮細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)6、12、24、48 h；對照組則以1 mL EpiLife代替菌液。實(shí)驗(yàn)組及對照組陪養(yǎng)6、12、24、48 h取上清液以ELISA法檢測IL-4、IL-8、TNF-α水平。

1.2.5電鏡觀察致病菌對上皮細(xì)胞的侵襲過程 細(xì)胞爬片24 h，換液加1 mL EpiLife及100 μL上述VVC(VVC組)、RVVC(RVVC組)致病菌各1株菌液繼續(xù)培養(yǎng)6、12、24、48 h；對照組則以等量EpiLife代替菌液。掃描電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

2 結(jié) 果

2.1體外培養(yǎng)小鼠陰道上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征 小鼠陰道上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)傳代后，電鏡下可見所培養(yǎng)上皮細(xì)胞表面布滿皺褶微絨毛，呈不規(guī)則疏網(wǎng)狀，細(xì)胞觸角細(xì)長，細(xì)胞邊緣連接處,形成清楚的細(xì)胞分界線，細(xì)胞緊密相連、呈鋪石狀排列，見圖1。

圖1 小鼠陰道上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)(掃描電鏡×600)

2.2小鼠陰道上皮細(xì)胞與白假絲酵母菌共培養(yǎng)后的形態(tài)學(xué)變化 培養(yǎng)6 h后，VVC、RVVC組細(xì)胞微絨毛較對照組減少，部分細(xì)胞縮小，胞體變圓凸起呈滴狀，少量孢子附著。培養(yǎng)12 h后，VVC組少量孢子附著在細(xì)胞周圍，細(xì)胞間隙增大；RVVC組大量孢子聚集，細(xì)胞表面微絨毛減少、消失，部分孢子轉(zhuǎn)化為菌絲。培養(yǎng)至24 h，VVC組細(xì)胞被菌絲侵蝕，表面形成孔洞，部分細(xì)胞塌陷，胞質(zhì)外溢，偶見殘缺的細(xì)胞輪廓和菌絲；RVVC組菌絲穿透細(xì)胞膜在細(xì)胞內(nèi)生長，微絨毛消失，細(xì)胞萎縮，部分細(xì)胞殘缺不全，大量菌絲纏繞。培養(yǎng)至48 h，VVC、RVVC組均見大量殘缺不全的細(xì)胞殘骸并纏繞附著成團(tuán)的菌絲，核中央形成空洞。RVVC致病白假絲酵母菌表現(xiàn)出比VVC致病菌更強(qiáng)的黏附性、穿透性、破壞性,見圖2。

A:VVC組6 h(掃描電鏡×1 200)；B:RVVC組6 h(掃描電鏡×1 000)；C：VVC組12 h(掃描電鏡×400)；D:RVVC組12 h(掃描電鏡×900);E:VVC組24 h(掃描電鏡×900);F:RVVC組24 h(掃描電鏡×900);G:VVC組48 h(掃描電鏡×1 200);H:RVVC組48 h(掃描電鏡×200)

圖2兩組電鏡掃描形態(tài)學(xué)分析

2.3小鼠陰道上皮細(xì)胞與白假絲酵母菌共培養(yǎng)后免疫細(xì)胞因子的表達(dá)情況 共培養(yǎng)12、24、48 h后，RVVC組IL-4、IL-8、TNF-α水平高于對照組(P<0.05)；VVC組IL-4、IL-8水平在共培養(yǎng)12、24、48 h后高于對照組，而TNF-α水平在6、12、24、48 h均高于對照組(P<0.05)。RVVC組IL-8水平在6、12、24、48 h均明顯高于VVC組，TNF-α水平在24、48 h高于VVC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，IL-4水平在兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。培養(yǎng)6、12、24 h后，VVC、RVVC組的IL-8、TNF-α水平均逐漸升高(P<0.05)，IL-4水平在共培養(yǎng)6、12、24 h逐漸升高(P<0.05),見表1。

表1 各組小鼠陰道上皮免疫細(xì)胞因子濃度

a:P<0.05，與對照組比較；b:P<0.05，與VVC組比較

3 討 論

成熟的鼠類陰道上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法主要有組織塊法和酶消化法。本研究采用酶分步消化法[6-7]。DispaseⅡ酶可成功分離上皮組織，具有細(xì)胞純度高、培養(yǎng)周期短的特點(diǎn)，可以快速獲得大量活性高的上皮細(xì)胞，能夠有效排除非上皮細(xì)胞的干擾[8-9]。掃描電鏡下細(xì)胞表面見許多微絨毛和脊樣胞質(zhì)皺褶,符合典型的鱗狀上皮細(xì)胞特點(diǎn)，體外培養(yǎng)上皮細(xì)胞成功。

本研究選取VVC和RVVC的主要致病菌種白假絲酵母菌(占60%～80%[10])為研究對象。作為條件致病菌，假絲酵母菌以酵母相少量存在于陰道中不引起臨床癥狀，當(dāng)陰道微環(huán)境的免疫低下時(shí)，酵母相轉(zhuǎn)變?yōu)榫z相并大量繁殖，從而致病[11]。假絲酵母菌對上皮細(xì)胞的黏附、穿透、破壞導(dǎo)致了對細(xì)胞的侵襲作用，是VVC發(fā)生的關(guān)鍵事件[12-13]。結(jié)果顯示，白假絲酵母菌發(fā)芽形成菌絲并黏附于上皮細(xì)胞單層，然后上皮細(xì)胞吞噬部分菌絲，導(dǎo)致白假絲酵母菌介導(dǎo)的上皮細(xì)胞裂解。酵母相發(fā)展為菌絲相伴隨著對細(xì)胞的黏附、穿透，同時(shí)細(xì)胞被破壞逐漸加重、脫落死亡；RVVC致病菌的轉(zhuǎn)變時(shí)間更短、破壞性更強(qiáng)。表明RVVC致病菌的侵襲性強(qiáng)于VVC。

Th細(xì)胞包括Th1、Th2等不同的亞型，各自亞型通過表達(dá)細(xì)胞因子實(shí)現(xiàn)免疫應(yīng)答作用。Th1表達(dá)IL-8、TNF-α等，IL-8通過正反饋調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞等活化、聚集，釋放出系列活性物質(zhì)，介導(dǎo)陰道局部的抵抗性免疫反應(yīng)，以殺菌和抑制細(xì)胞損傷[5]；同樣TNF-α增強(qiáng)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的吞噬活性，介導(dǎo)炎癥相關(guān)免疫應(yīng)答，增強(qiáng)機(jī)體對假絲酵母菌的抗性，清除病原體[14]。Th2分泌IL-4等，作為致病性細(xì)胞因子，IL-4響應(yīng)于假絲酵母菌抑制Th1介導(dǎo)的噬菌作用，增加對假絲酵母菌的易感性[15]。

本研究通過對Th1免疫因子IL-8、TNF-α及Th2 免疫因子IL-4的研究發(fā)現(xiàn)，隨時(shí)間的增加對照組上清液中Th1免疫因子IL-8、TNF-α、IL-4水平呈上升趨勢，提示陰道上皮細(xì)胞可能是Th細(xì)胞免疫因子的重要來源，說明正常陰道上皮細(xì)胞在沒有外界刺激的情況下也分泌少量免疫因子，發(fā)揮防御作用。表明在無法順利獲取人類陰道上皮細(xì)胞的情況下，可采用小鼠陰道上皮細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)研究。在實(shí)驗(yàn)組，感染后12 h的IL-8、TNF-α、IL-4水平上升，RVVC組中IL-8在感染中期(12 h)、TNF-α在感染后期(24 h)水平比VVC組升高，表明感染后上皮細(xì)胞出現(xiàn)了隨時(shí)間增強(qiáng)的抵抗性免疫反應(yīng)，并且RVVC組的抵抗力更強(qiáng)；而Th2代表因子IL-4水平在感染6～24 h隨時(shí)間上升，但后期(24 h以后)則沒有變化，RVVC與VVC組之間IL-4亦無差異，推測IL-4可能僅在感染早期的致病菌易感性中起了一定的作用，但是在RVVC與VVC的致病均易感性中并沒有明顯區(qū)別。

在感染后期，Th1/Th2比值增大，局部Th1占優(yōu)勢，陰道局部表現(xiàn)出對致病菌的抗性，對RVVC致病菌的抗性更強(qiáng)，表明Th1/Th2平衡在陰道局部免疫中具有重要作用；致病菌對上皮細(xì)胞的侵襲逐漸加重，RVVC菌株侵襲性更強(qiáng)。由此可見，致病菌侵襲性與陰道局部抵抗性免疫之間相互拮抗的結(jié)果和RVVC的演進(jìn)(即病情好轉(zhuǎn)或加重)息息相關(guān)，本研究在小鼠陰道上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，體外構(gòu)建陰道模型，結(jié)合致病菌侵襲力和免疫功能變化，希望為RVVC的發(fā)病機(jī)制提供新理論，有助于設(shè)計(jì)更有效的RVVC治療方式。