脂聯(lián)素對(duì)2型糖尿病大鼠心肌組織TGF-β1/Smads信號(hào)通路的影響

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糖尿病心肌病(DCM)是一種獨(dú)立的糖尿病心血管并發(fā)癥，其主要病理改變?yōu)樾募±w維化(MF)，其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)在MF的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1-2]。脂聯(lián)素(ADPN)可能具有心臟保護(hù)作用，但機(jī)制尚不完全清楚[3]。本研究探討球型脂聯(lián)素(gAd)對(duì)2型糖尿病(T2DM)大鼠MF中TGF-β1/Smad通路的影響，揭示gAd保護(hù)心肌、降低MF的可能機(jī)制，為防治DCM提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 體重160～180 g的SPF級(jí)健康雄性SD大鼠80只(山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心)；普通飼料(山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心)；高脂高糖料(北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供)；鏈脲佐菌素(STZ，美國(guó)Sigma公司提供)；gAd(美國(guó)BioVision公司提供)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模及分組 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為NC組(n=24)，造模組(n=56)，分別予普通飼料和高脂高糖料喂養(yǎng)。8周后，禁食12 h，造模組給予STZ 30 mg/kg一次性腹腔注射，NC組注射同等劑量緩沖液。72 h后測(cè)隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L，且出現(xiàn)多尿、多飲、多食現(xiàn)象即造模成功，最終造模成功52只。繼續(xù)喂養(yǎng)6周，將成模大鼠隨機(jī)分為糖尿病心肌病組(DCM組，n=26)、DA干預(yù)組(DA組，n=26)。DA組大鼠每日腹腔注射gAd 10 μg/kg，DCM組和NC組大鼠每日注射同等劑量生理鹽水。

1.2.2 心功能測(cè)定 大鼠稱重，麻醉，超聲評(píng)價(jià)左心室功能，測(cè)量左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、射血分?jǐn)?shù)(EF)和左室短軸縮短率(FS)。

1.2.3 標(biāo)本采集 于藥物干預(yù)4周末、8周末、12周末隨機(jī)取8只大鼠，麻醉后腹主動(dòng)脈采血測(cè)空腹血糖(FBG)。暴露胸腔，取心臟稱重，計(jì)算心臟重量指數(shù)(HWI)，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗后吸干水分，取左心室同一部位心肌，部分用10%中性甲醛固定后石蠟包埋切片，HE染色光鏡觀察心肌組織形態(tài)，剩余部分液氮凍透后-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)心肌組織Smad3、Smad7、TGF-β1mRNA表達(dá) 提取心肌組織RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，行RT-PCR擴(kuò)增：94 ℃預(yù)變性10 min，活化Tag酶，94 ℃變性15 s，60 ℃復(fù)性60 s，共45個(gè)循環(huán)。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.5 蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測(cè)心肌組織Smad3、Smad7、TGF-β1蛋白表達(dá) 心肌組織50 mg加入0.5 mL裂解液，超聲裂解勻漿，4 ℃離心10 min取上清。電泳后轉(zhuǎn)膜，5%牛血清白蛋白(BSA)封閉過(guò)夜，TBST以1∶1 000 稀釋兔源TGF-β1、Smad3、Smad7抗體(美國(guó) Cell Signaling 公司)4 ℃ 孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育2 h，ECL底物化學(xué)發(fā)光顯色、顯影、定影、掃描。

2 結(jié) 果

2.1 一般指標(biāo)與心臟超聲 各時(shí)間段中，與NC組比較，DCM組大鼠FBG升高(P<0.05)，DA組FBG有所下降，但未降至正常水平；DCM組HWI較同期NC組增加(P<0.05)，DA組干預(yù)12周后HWI較DCM組下降(P<0.05)；心臟超聲顯示，與NC組比較，DCM組心功能減退，DA組干預(yù)8周、12周后較DCM組心功能改善(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠FBG、HWI和心功能指標(biāo)比較(±s)

與NC組同時(shí)間比較，1)P<0.05；與DCM組同時(shí)間比較，2)P<0.05；與同組4周時(shí)比較，3)P<0.05；與同組8周時(shí)比較，4)P<0.05

2.2 心肌組織HE染色 NC組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)正常，胞核排列整齊；DCM組細(xì)胞大小不一、形態(tài)紊亂，呈多形核，細(xì)胞間質(zhì)增多；DA組上述病理改變較DCM組減輕，細(xì)胞排列略紊亂。詳見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化(200×)

2.3 各組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad3、Smad7 mRNA表達(dá)水平比較 與同期NC組比較，DCM組心肌組織TGF-β1、Smad3 mRNA表達(dá)增加(P<0.05)，Smad7表達(dá)減低(P<0.05)，呈時(shí)間依賴性；與同期DCM組比，DA組TGF-β1、Smad3 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)，Smad7 mRNA表達(dá)增加(P<0.05)，呈時(shí)間依賴性。詳見表3。

2.4 各組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白表達(dá)水平比較 各時(shí)間段，DCM組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)較NC組增加(P<0.05)，Smad7蛋白表達(dá)較NC組減少(P<0.05)，呈時(shí)間依賴性；而DA組干預(yù)后TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)較DCM組減少(P<0.05)，Smad7蛋白表達(dá)較DCM組增加(P<0.05)，呈時(shí)間依賴性。詳見圖2、表4。

表3 各組大鼠不同時(shí)間心肌組織TGF-β1、Smad3、Smad7 mRNA表達(dá)水平比較(±s)

與NC組同時(shí)間比較，1)P<0.05；與DCM組同時(shí)間比較，2)P<0.05

圖2 各組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白的表達(dá)

時(shí)間組別 TGF-β1 Smad3 Smad74周NC組0.85±0.010.82±0.021.17±0.02DCM組1.26±0.041)1.09±0.041)0.68±0.011)DA組 0.97±0.021)2) 0.96±0.051)2) 0.72±0.021)2)8周NC組0.88±0.020.64±0.021.06±0.02DCM組1.32±0.021)1.11±0.041)0.63±0.021)DA組 0.92±0.011)2) 0.74±0.011)2) 0.95±0.011)2)12周NC組0.72±0.010.56±0.001.07±0.01DCM組1.33±0.011)1.33±0.021)0.53±0.001)DA組 0.89±0.011)2) 0.66±0.021)2) 1.03±0.011)2)

與NC組比較，1)P<0.05；與DCM組比較，2)P<0.05

3 討 論

2013年美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)基金會(huì)/美國(guó)心臟協(xié)會(huì)(ACCF/AHA)心力衰竭指南明確提出DCM概念[4]，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，可能機(jī)制包括MF、胰島素抵抗、細(xì)胞異常凋亡、氧化應(yīng)激、細(xì)胞代謝紊亂、線粒體損傷、鈣穩(wěn)態(tài)失衡等，其中MF是DCM的特征性表現(xiàn)。

TGF-β1是致纖維化因子，可刺激心臟成纖維細(xì)胞增生、膠原合成、心肌細(xì)胞肥大、心室重構(gòu)，與MF密切相關(guān)[1]。Smad依賴性信號(hào)通路是TGF-β1誘導(dǎo)纖維化經(jīng)典的信號(hào)通路[5]。Smads家族包含3大亞型9種Smad蛋白，分別為膜受體激活型Smad(R-Smad)、通用型Smad(Co-Smad)和抑制型Smad(I-Smad)。Smad3為R-Smad的一種，TGF-β與其胞膜受體結(jié)合后，Smad3磷酸化，進(jìn)而與Smad4(Co-Smad)形成復(fù)合物進(jìn)入核內(nèi)調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄[6-7]。除經(jīng)典的Smad3/4通路，TGF-β亦可通過(guò)非經(jīng)典的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激活激酶1(TAK1)/p38/氨基末端激酶(JNK)和NADPH氧化酶4(NOX4)/活性氧(ROS)通路，導(dǎo)致膠原基因表達(dá)[8]。Smad7為I-Smad，可競(jìng)爭(zhēng)性抑制R-Smad與受體結(jié)合，是TGF-β信號(hào)通路的抑制因子。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與同期NC組比較，超聲顯示DCM組大鼠LVEDD、EF、FS減小，而LVESD增大，且呈時(shí)間依賴性，同時(shí)HWI隨病程逐漸增加。表明隨著病程進(jìn)展，DCM逐漸加重，發(fā)生心室重構(gòu)，心功能逐漸惡化。與同期NC組比較，DCM組心肌組織TGF-β1、Smad3表達(dá)增加，Smad7表達(dá)減低，呈時(shí)間依賴性，提示DCM大鼠MF與TGF-β1/Smads通路激活有關(guān)。

ADPN是主要由脂肪細(xì)胞分泌的脂肪因子，與膠原蛋白和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)結(jié)構(gòu)相似，其中g(shù)Ad是ADPN實(shí)現(xiàn)生物效應(yīng)的主要區(qū)域[9]。ADPN具有增加胰島素敏感性、抗炎及血管保護(hù)作用[10]。多個(gè)研究表明ADPN具有心臟保護(hù)作用，ADPN可增強(qiáng)小鼠心臟成纖維細(xì)胞過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體-α(PPAR-α)活性，改善MF[11]。ADPN抑制血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)的核因子-κB(NF-κB)的表達(dá)，減少炎癥因子表達(dá)，通過(guò)激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)通路促進(jìn)活化的巨噬細(xì)胞自噬，減輕炎癥反應(yīng)和MF[12]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ADPN可抑制離體培養(yǎng)的心肌細(xì)胞TGF-β1/Smads通路的激活[13]。本實(shí)驗(yàn)外源性給予DCM大鼠gAd后心肌組織TGF-β1、Smad3 mRNA及蛋白表達(dá)較同期DCM組均明顯減少，Smad7 mRNA及蛋白表達(dá)明顯增加，且呈時(shí)間依賴性；此外，gAd干預(yù)12周后心功能改善，HWI較DCM組下降，說(shuō)明gAd作用具有時(shí)間依賴性。以上結(jié)果表明gAd通過(guò)抑制心肌組織TGF-β1/Smads信號(hào)通路改善DCM，且具有時(shí)間依賴性。

綜上所述，gAd通過(guò)影響TGF-β1/Smads通路改善DCM大鼠MF進(jìn)展，改善血漿gAd水平可能成為DCM治療的有效手段。