加味四逆湯對(duì)充血性心力衰竭大鼠血管緊張素Ⅱ、醛固酮及心功能的影響

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充血性心力衰竭的致殘率和死亡率均較高，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量。心力衰竭歸屬于中醫(yī)學(xué)“心悸”“喘證”“水腫”等范疇，其基本發(fā)病機(jī)制為陽氣衰微、水瘀內(nèi)停，臨床上采用溫陽益氣、活血利水治療原則[1-2]。該病發(fā)生可降低病人心功能，其中血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)和醛固酮(ALD)是引起該病發(fā)生的重要因子[3]。本研究探討加味四逆湯對(duì)充血性心力衰竭大鼠AngⅡ、ALD及心功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 健康雄性大鼠40只，體重220±12 g，購于河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。AngⅡ、ALD兔抗鼠一抗，購于美國Abcam公司；AngⅡ、ALD試劑盒，購于南京建成生物工程研究所；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)及血管緊張素1型受體(AT1R)檢測(cè)試劑盒，購于上海嵐派生物科技有限公司。

1.2 加味四逆湯 組方：炮附子(先煎)15 g，赤芍12 g，紅參、吳茱萸、丹參、當(dāng)歸、官桂、甘草各10 g，茯苓、干姜(炒)、益母草各30 g，白術(shù)18 g?；旌虾笏逯?，由本醫(yī)院藥劑科統(tǒng)一購入并制成顆粒劑，使用時(shí)1 mL含生藥量按4.0 g計(jì)算，并溶解于生理鹽水中[4]。

1.3 動(dòng)物模型建立及實(shí)驗(yàn)分組 選取雄性大鼠40只，隨機(jī)分為空白組、假手術(shù)組、模型組及加味四逆湯處理組，各10只。采用結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支制備心肌梗死后心力衰竭模型為模型組，空白組為不經(jīng)任何處理的正常大鼠，假手術(shù)組為開胸不進(jìn)行心臟血管手術(shù)處理的大鼠，加味四逆湯處理組給予加味四逆湯灌胃。4組大鼠均于術(shù)后4 d 開始灌胃給藥，連續(xù)至檢測(cè)當(dāng)天，其中空白組、假手術(shù)組和模型組給予氯化鈉注射液灌胃，加味四逆湯處理組給予加味四逆湯灌胃，灌胃量16 mL/kg。

1.4 心功能測(cè)定 連續(xù)給藥分別在心力衰竭早期和晚期應(yīng)用超聲心動(dòng)圖檢測(cè)4組大鼠心功能[5]，采用心臟超聲儀檢測(cè)心功能情況，檢測(cè)指標(biāo)主要包括左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)及左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。

1.5 AngⅡ及ALD水平測(cè)定 采集大鼠血液時(shí)不加抗凝劑，室溫靜置1～2 h，離心后取上清液，-80 ℃分裝保存?zhèn)溆谩２捎梅派涿庖叻ǘ繙y(cè)定血清AngⅡ和ALD濃度[6]。所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 大鼠心臟ACE和AT1R mRNA水平表達(dá) 按照ACE和AT1R試劑盒說明書進(jìn)行操作。首先制備電泳膠，之后按照操作要求將制備好的電泳膠放入電泳槽，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方法在PCR熱循環(huán)儀中將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，ACE引物：上游5′-GAAGTCACCCGCGTGCTAAT-3′，下游5′-TCACTGCTCCCGAATGTCT-3′；AT1R引物：上游5′-GTGTGATGAGCCCAAGGA -3′，下游5′-GCAGTTGGCTCGCATCATAG- 3′。同時(shí)將PCR產(chǎn)物倒入，加入緩沖液(6×Loading Buffer)，樣本混勻后放入電泳膠孔[7]。PCR反應(yīng)條件[8]：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性反應(yīng)45 s，52 ℃條件下退火45 s，72 ℃延伸反應(yīng)1.5 min，重復(fù)35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸反應(yīng)15 min，之后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后采用1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物?？刂齐娪倦妷?00 V，將電泳膠放入凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并照相。

1.7 蛋白免疫印跡(western blot)法檢測(cè)大鼠心臟ACE和AT1R蛋白水平表達(dá)[9]大鼠心臟細(xì)胞經(jīng)過處理后，37 ℃孵育24 h，棄去培養(yǎng)液，應(yīng)用磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，之后用蛋白裂解液使細(xì)胞裂解，放置于冰上保持5 min后，樣品加入1/4體積的4組蛋白如上樣緩沖液，沸水煮沸5 min，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，之后轉(zhuǎn)印至聚偏氧乙烯(PVDF)膜上，用含按約0.1 mL/cm2量加入封閉液封閉1 h，一抗4 ℃過夜。次日磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)漂洗3次，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，ECL顯色。用SDS-PAGE進(jìn)行電泳，并將其轉(zhuǎn)膜到硝酸纖維素膜上。對(duì)抗體孵育處理，經(jīng)化學(xué)發(fā)光法曝光后觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 4組大鼠心功能指標(biāo)比較 與空白組和假手術(shù)組比較，模型組和加味四逆湯處理組大鼠LVEF明顯降低(P<0.05)，LVESD及LVEDD均明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，加味四逆湯處理組LVEF明顯升高(P<0.05)，LVESD及LVEDD明顯降低(P<0.05)。詳見表1。

表1 4組大鼠心功能指標(biāo)比較(±s)

與空白組比較，1)P<0.05；與假手術(shù)組比較，2)P<0.05；與模型組比較，3)P<0.05

2.2 4組大鼠血漿AngⅡ及ALD水平比較 與空白組和假手術(shù)組比較，模型組和加味四逆湯處理組血漿AngⅡ及ALD水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，加味四逆湯處理組血漿AngⅡ及ALD水平明顯降低(P<0.05)。詳見表2。

表2 4組血漿AngⅡ及ALD水平比較(±s) ng/L

與空白組比較，1)P<0.05；與假手術(shù)組比較，2)P<0.05；與模型組比較，3)P<0.05

2.3 4組大鼠ACE和AT1R mRNA比較 與空白組和假手術(shù)組比較，模型組和加味四逆湯處理組心臟ACE和AT1R mRNA水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，加味四逆湯處理組心臟ACE 和AT1R mRNA明顯降低(P<0.05)。詳見表3。

表3 4組大鼠ACE和AT1R mRNA比較(±s)

與空白組比較，1)P<0.05；與假手術(shù)組比較，2)P<0.05；與模型組比較，3)P<0.05

2.4 4組大鼠ACE和AT1R蛋白水平比較 與空白組和假手術(shù)組比較，模型組和加味四逆湯處理組心臟ACE和AT1R蛋白水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，加味四逆湯處理組心臟ACE和AT1R蛋白水平明顯降低(P<0.05)。詳見表4。

表4 4組大鼠ACE和AT1R蛋白水平比較(±s) U/mL

與空白組比較，1)P<0.05；與假手術(shù)組比較，2)P<0.05；與模型組比較，3)P<0.05

3 討 論

充血性心力衰竭的發(fā)病過程中，《傷寒論》主張真武湯治療心力衰竭，心力衰竭腎陽虛不能制水，水氣凌心，真武湯含炮附子、白術(shù)、茯苓、生姜和芍藥5味[10]。本研究采用加味四逆湯治療，其中炮附子溫壯腎陽，白術(shù)健脾燥濕，茯苓淡滲利水，生姜助附子溫陽，芍藥斂陰和營，溫陽散水不傷陰；吳茱萸滋補(bǔ)肝脾，輔以滋補(bǔ)腎中之陰；以紅參、丹參、當(dāng)歸溫補(bǔ)腎陽，可微生少火以生腎氣；官桂、甘草合用化陽以溫通心陽[11-12]。

心力衰竭發(fā)生時(shí)，伴有不同程度的心功能和血流動(dòng)力學(xué)改變，這是心臟從代償階段逐漸發(fā)展至失代償?shù)牟±砩韺W(xué)變化[13-15]。這種病理變化與心臟AngⅡ、ALD活性有關(guān)。有研究顯示，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)在維持機(jī)體水、電解質(zhì)及血壓平衡方面發(fā)揮重要作用，RAAS活性增強(qiáng)，參與慢性心力衰竭的發(fā)生發(fā)展[16]。因此，其中任何一個(gè)因素發(fā)生變化將導(dǎo)致心力衰竭發(fā)生，且隨著活性增加，加重該病的發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，加味四逆湯處理可抑制大鼠心臟AngⅡ、ALD活性增強(qiáng)，而且抑制與之相關(guān)的ACE及AT1R蛋白活性，說明加味四逆湯可改善影響心力衰竭發(fā)病的病理因素變化。

心功能減弱是充血性心力衰竭的一個(gè)重要表現(xiàn)，為改善心功能，多進(jìn)行藥物治療。加味四逆湯治療后可增強(qiáng)心肌收縮力，減慢心率，增加心肌血流灌注，抑制脂肪分解，減少游離脂肪酸的生成，降低心肌細(xì)胞對(duì)脂肪酸的利用，從而降低心肌耗氧量[17-18]，進(jìn)而增強(qiáng)心臟的心功能。相關(guān)研究顯示，無論采用何種藥物進(jìn)行干預(yù)處理后大鼠心功能指標(biāo)LVEF、LVESD及LVEDD均會(huì)發(fā)生變化[17-20]。本研究結(jié)果顯示采用加味四逆湯治療后大鼠LVEF、LVESD及LVEDD明顯改善。因此，加味四逆湯通過抑制心力衰竭大鼠心臟AngⅡ、ALD活性增強(qiáng)，從而改善充血性心力衰竭大鼠心功能。