丙型肝炎病毒抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒穩(wěn)定性評價探討

閆渝松，唐 娟，周雪蓮

(重慶市大足區(qū)人民醫(yī)院，重慶 402360)

丙型肝炎病毒抗體(抗-HCV)檢測是我國法定血液篩查項目之一，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測方法是目前檢測抗-HCV的主要檢測方法，目前絕大多數(shù)血站還是采用“兩遍酶免+一遍核酸”的檢測策略[1]?！堆炯夹g(shù)操作規(guī)程》(2015版)正式提出了病毒核酸檢測試劑通過批簽發(fā)之后可采用“一遍酶聯(lián)免疫+一遍核酸”的檢測策略[2]。由于不同的檢測試劑和系統(tǒng)之間存在差異[3-4]，在改變血液檢測策略、減去一遍酶聯(lián)免疫檢測實驗時，如何對現(xiàn)用的檢測試劑進(jìn)行取舍需要非常慎重地決策。選擇試劑時需要對試劑性能進(jìn)行全面考察。試劑使用期間的穩(wěn)定性是試劑的重要性能之一，需要進(jìn)行有效地評估才能選擇適合本實驗室使用的試劑。為此，本實驗室以抗-HCV試劑盒(ELISA法)為例，對該試劑在2017年4月至2018年3月使用期間的穩(wěn)定性評價進(jìn)行探索，評價試劑盒使用期內(nèi)批內(nèi)穩(wěn)定性、日間穩(wěn)定性和批間穩(wěn)定性三方面性能，為選擇試劑血液篩查試劑提供參考。

1 材料與方法

1.1標(biāo)準(zhǔn)血清 濃度為0.5 NCU/mL的抗-HCV標(biāo)準(zhǔn)血清(北京康徹思坦，批號：201710021)。

1.2儀器與試劑 RT-6100酶標(biāo)儀(深圳杜雷公司)；抗-HCV ELISA檢測試劑盒(廈門英科新創(chuàng)科技有限公司，批號：2017035809,2017075817，2017125830)。

1.3方法

1.3.1檢測方法 抗-HCV檢測試劑盒和標(biāo)準(zhǔn)血清從試劑儲存冰箱取出后在18～25 ℃室溫條件下平衡40 min。按照試劑說明書參數(shù)要求和步驟檢測標(biāo)準(zhǔn)血清。檢測完成后，根據(jù)試劑說明書的Cut off值計算公式計算每次實驗的Cut off值和標(biāo)準(zhǔn)血清的S/Co值。

1.3.2質(zhì)控保障措施 嚴(yán)格控制標(biāo)準(zhǔn)血清和試劑盒在室溫平衡溫度和時間。標(biāo)準(zhǔn)血清復(fù)融后充分混勻，每次檢測混勻次數(shù)控制在30次左右，排除質(zhì)控品凍融過程對檢測結(jié)果的影響。選擇S/Co值在2～5的標(biāo)準(zhǔn)血清作為質(zhì)控品，能夠更靈敏地反映試劑的性能。

1.3.3試劑盒批內(nèi)穩(wěn)定性評價 每一批試劑投入使用前，在同一次試驗中、同一塊酶標(biāo)板內(nèi)、對一次混勻的標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行重復(fù)檢測，每一批試劑檢測40孔(n=40)。分析每孔檢測結(jié)果的S/Co值之間的差異，以此來評價抗-HCV試劑盒的批內(nèi)穩(wěn)定性。

1.3.4試劑盒日間穩(wěn)定性評價 記錄每一批試劑使用期內(nèi)每一天檢測的室內(nèi)結(jié)果，采用變異系數(shù)(CV)來分析檢測結(jié)果日間差異性，評價抗-HCV試劑盒使用期的日間穩(wěn)定性。

1.3.5批間穩(wěn)定性評價 收集分析的3批次試劑使用期內(nèi)室內(nèi)質(zhì)控的檢測結(jié)果，分析3批次試劑之間的差異性，評價抗-HCV試劑盒使用期內(nèi)的批間穩(wěn)定性。

2 結(jié) 果

表1 3批次試劑批內(nèi)穩(wěn)定性評價結(jié)果

圖1 抗-HCV試劑盒批內(nèi)穩(wěn)定性箱線圖分析結(jié)果

表2 3批次抗-HCV試劑盒日間穩(wěn)定性評價結(jié)果

圖2 抗-HCV試劑盒日間穩(wěn)定性箱線圖分析結(jié)果

3 討 論

2015年底我國實現(xiàn)了獻(xiàn)血者血液病毒核酸檢測全覆蓋[6]，在國家對核酸檢測試劑實行批簽發(fā)之前，本單位仍采用“兩遍酶免+一遍核酸”的血液檢測策略。2017年4月至2018年3月本單位使用了3批次ELISA抗-HCV試劑進(jìn)行了231次檢測,篩查獻(xiàn)血者血液是否符合國家要求。檢測試劑使用期間的穩(wěn)定性是試劑性能評價的主要內(nèi)容之一，對血液篩查結(jié)果非常重要，性能穩(wěn)定的血液篩查試劑是開展獻(xiàn)血者感染性指標(biāo)檢測的重要基礎(chǔ)[7]。本實驗室對3批試劑的231次室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計分析來評估試劑的穩(wěn)定性。

在試劑使用期間穩(wěn)定性評價過程中，本實驗室選用抗-HCV水平為0.5 NCU/mL標(biāo)準(zhǔn)血清作為質(zhì)控品。在本實驗室檢測條件下，采用英科新創(chuàng)ELISA抗-HCV試劑盒檢測標(biāo)準(zhǔn)血清的S/Co值大部分結(jié)果在3～5。這個檢測結(jié)果范圍能夠靈敏地反應(yīng)試劑盒的穩(wěn)定性[2]。本研究實驗過程中使用同一廠家、同一批號的標(biāo)準(zhǔn)血清作為試劑穩(wěn)定性評價材料。每一次檢測前的準(zhǔn)備過程中，凍存標(biāo)準(zhǔn)血清的復(fù)融條件和混勻操作進(jìn)行了嚴(yán)格的控制。復(fù)融溫度、復(fù)融時間、混勻方式和顛倒混勻次數(shù)都進(jìn)行了統(tǒng)一的規(guī)定，工作人員之間操作定期進(jìn)行人員比對。這些質(zhì)量控制項目可以減少材料不均一和工作人員之間操作的差異對評價結(jié)果的影響，以客觀、有效地評價試劑盒穩(wěn)定性。

在評價結(jié)果分析環(huán)節(jié)，本研究采用了兩種評價方法對ELISA抗-HCV試劑的穩(wěn)定性進(jìn)行了評價。一方面，本實驗室采用了CV值判斷試劑使用期間的批內(nèi)、日間和批間差異性。使用CV值判斷試劑穩(wěn)定性可以對試劑的總體穩(wěn)定性作出評價[8]。另一方面，本研究還進(jìn)一步使用了箱線圖來回顧性地分析質(zhì)控結(jié)果，用于判斷每一批次質(zhì)控結(jié)果中出現(xiàn)極值的情況。當(dāng)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)血清檢測結(jié)果的S/Co值大于3倍四分位數(shù)間距時判定為極值。采用箱線圖分析質(zhì)控血清檢測結(jié)果能夠更加敏感地反應(yīng)試劑在使用過程中出現(xiàn)的某一次檢測結(jié)果的異?，F(xiàn)象[9]。綜合上述兩個評價指標(biāo)來反映抗-HCV試劑盒在使用過程中的穩(wěn)定性更加科學(xué)和有效。

ELISA試劑的批內(nèi)穩(wěn)定性代表該批次試劑酶標(biāo)板的每一孔之間的差異[10]。本實驗室3個批次的試劑采用同一次混勻的標(biāo)準(zhǔn)血清重復(fù)檢測40孔，3批次試劑結(jié)果S/Co值的變異系數(shù)分別為8.6%、7.4%和8.1%，3批次試劑在對標(biāo)準(zhǔn)血清的檢測中均未出現(xiàn)極值，說明被評價的試劑盒孔間差異較小，具有較好的批內(nèi)穩(wěn)定性。試劑盒的日間精密度是代表試劑使用期間日間的穩(wěn)定性的指標(biāo)[11]，可以反映試劑盒在常規(guī)儲存環(huán)境條件及檢測條件下維持檢測性能的能力。本實驗室統(tǒng)計分析了3批次試劑盒在使用期間連續(xù)檢測同一批號標(biāo)準(zhǔn)血清的結(jié)果，3批試劑CV值均小于15%，符合常規(guī)質(zhì)控的標(biāo)準(zhǔn)。在箱線圖分析結(jié)果中，箱線圖分析結(jié)果中，2017035809批次試劑在第42天出現(xiàn)1個高于上四分位間距的極值，出現(xiàn)極值的概率為1.2%；2017075817在第15天、第16天和第35天出現(xiàn)3個高于上四分位間距的極值，概率為3.1%；2017125830批次試劑使用期間未出現(xiàn)極值。分析結(jié)果說明該試劑盒在本實驗室的儲存環(huán)境條件和實驗條件下能夠維持較為穩(wěn)定的檢測能力，具有較好的日間穩(wěn)定性。ELISA試劑的批間穩(wěn)定性反映每一批試劑之間的差異。該性能受試劑盒生產(chǎn)原材料、制備工藝、后期運輸和儲存條件等因素的影響[12]。本研究統(tǒng)計3批次試劑在使用期間檢測標(biāo)準(zhǔn)血清的結(jié)果，總體CV=10.5%，符合ELISA試劑批間差異小于20%的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，說明該試劑盒批間穩(wěn)定性較好。

在改變血液篩查策略時，應(yīng)盡量選擇穩(wěn)定性好的試劑用于血液篩查[13]。本研究對結(jié)合批內(nèi)檢測數(shù)據(jù)和室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對ELISA抗-HCV試劑盒在使用期間的批內(nèi)穩(wěn)定性、日間穩(wěn)定性和批間穩(wěn)定性等三方面穩(wěn)定性能進(jìn)行全面評價，可為在選擇抗-HCV篩查試劑提供部分參考依據(jù)。