葉酸水平、MTHFR基因C677T多態(tài)性與宮頸癌的相關(guān)性研究

薛雄燕,朱嫦琳,潘練華,黃少珍,黃燕婷,馬婉珍,李煒煊

(佛山市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣東佛山 528000)

宮頸癌是婦女常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率高，嚴(yán)重影響廣大婦女的身心健康。宮頸癌的發(fā)生是多階段、多步驟，有多重因素參與，其中已有研究指出葉酸缺乏與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1-3]，但目前得到的結(jié)論并不一致。葉酸生物學(xué)作用的發(fā)揮受到體內(nèi)一些酶的影響，其中，5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是葉酸代謝過程中的關(guān)鍵酶，在葉酸參與DNA甲基化反應(yīng)的過程中起重要作用。MTHFR基因具有單核苷酸多態(tài)性，多態(tài)性位點(diǎn)的突變可引起其編碼的酶活性下降，推測(cè)可能與葉酸水平變化相關(guān)。因此，本研究通過檢測(cè)宮頸癌患者及正常對(duì)照者血清葉酸水平及分析MTHFR基因C677T多態(tài)性，明確其與宮頸癌易感性的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 病例組選自2015年3月至2018年2月佛山市第一人民醫(yī)院婦科及腫瘤內(nèi)科住院的確診為宮頸癌患者82例作為病例組，均為女性，年齡36～51歲，平均(44.39±3.74)歲。病例組宮頸癌分期為二期38例，三期44例。組織學(xué)分型為腺癌6例，鱗癌76例。對(duì)照組選取同期與病例無血緣關(guān)系的體檢者共82例，均為女性，年齡35～52歲，平均(45.12±3.89)歲。所有研究對(duì)象均為人類乳頭瘤病毒(HPV)-16陽性，兩組年齡和性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn) 病例組患者均經(jīng)病理確診為宮頸癌。所有納入研究的人群均排除合并嚴(yán)重心、肝、腎、肺疾病者、妊娠期及哺乳期婦女、合并其他惡性腫瘤者，所有研究對(duì)象無血緣關(guān)系。

1.3MTHFR基因C677T多態(tài)性檢測(cè)原理 采用聚合酶鏈反應(yīng)和限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)方法，擴(kuò)增產(chǎn)物由識(shí)別多態(tài)性位點(diǎn)的特異性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切片段經(jīng)電泳分析，根據(jù)電泳條帶區(qū)分基因型。

1.4儀器與試劑 采用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝管采集研究對(duì)象外周靜脈血2 mL，用于MTHFR基因C677T多態(tài)性檢測(cè)，采用黃色促凝膠真空采血管采集周靜脈血3 mL，3 500 r/min離心10 min后，上層血清用于葉酸檢測(cè)。亞甲基四氫葉酸還原酶基因677C/T 檢測(cè)試劑盒(PCR-RFLP)購自深圳市奧薩制藥有限公司，檢測(cè)儀器為ABI公司7500熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀。葉酸檢測(cè)采用Roche公司E601全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光分析儀及配套試劑。所有操作嚴(yán)格按照說明書。

1.5檢測(cè)方法

1.5.1DNA提取 在1.5 mL離心管中加入300 μL充分搖勻的變性液及55 μL抗凝全血，室溫放置5 min后，12 000 r/min離心3 s，棄去上清，在管底紅褐色沉淀中加分次加入洗滌液A、洗滌液B和無水乙醇洗滌后離心棄去上清，沉淀置于65 ℃金屬浴中干燥約20 min后，加入55 μL溶解液混勻，12 000 r/min離心3 s，吸取上清備用。

1.5.2PCR擴(kuò)增反應(yīng) 在PCR反應(yīng)管中加入試劑盒中的PCR擴(kuò)增混合液21.8 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL及待檢DNA樣品3 μL，置于PCR擴(kuò)增儀按以下擴(kuò)增程序進(jìn)行：94 ℃變性30 s、65 ℃退火45 s、72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)。

1.5.3酶切反應(yīng) 每管加入酶切緩沖液4.7 μL、限制性內(nèi)切酶0.3 μL和10 μLPCR產(chǎn)物，37 ℃溫育1 h。

1.5.4電泳檢測(cè)及結(jié)果分析 采用1×TBE配制2%瓊脂糖凝膠，酶切反應(yīng)管中加入電泳上樣緩沖液5 μL，取10 μL加入瓊脂糖凝膠加樣孔中，5 v/cm電壓下電泳45 min，根據(jù)電泳帶型模式圖判斷基因型。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。等位基因頻率用基因頻率計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)算，Hardy-Weinberg(H-w)平衡采用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)，組間的基因型及基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)，應(yīng)用OR值及其95%的可信區(qū)間(CI)來估計(jì)其相對(duì)危險(xiǎn)度；P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1血清葉酸水平與宮頸癌的關(guān)系 病例組血清葉酸水平(8.63±5.63) μg/L低于對(duì)照組(10.84±5.99)μg/L，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.43，P=0.016)。

2.2不同組別MTHFR基因C677T基因型分布情況 對(duì)病例組和對(duì)照組的MTHFR基因C677T位點(diǎn)各基因分布進(jìn)行Hardy-weinberg平衡檢驗(yàn)，分布符合遺傳平衡法則(P>0.05)，說明樣本具有代表性，各種基因型電泳圖見圖1。表1顯示了MTHFR基因C677T各基因型的分布情況。其中，病例組和對(duì)照組均為雜合型(CT)頻率最高，病例組純合型(TT)高于野生型(CC)，而對(duì)照組則相反。兩組間各基因型頻率不一致，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.529，P=0.023)。兩組人群MTHFR基因C677T等位基因頻率比較結(jié)果顯示，病例組T等位基因頻率高于C等位基因，與對(duì)照組的基因分布不一致，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.903，P=0.015)。

注：1純合型(TT)；2雜合型(CT)； 3野生型(CC)； 4雜合型(CT)； 5雜合型(CT)； 6陽性質(zhì)控

圖1 各種基因型電泳圖

2.3MTHFR基因C677T多態(tài)性與宮頸癌易感性分析 與野生型(CC)人群相比，純合型(TT)人群患宮頸癌的危險(xiǎn)性顯著增高(OR=3.485，95%CI：1.331～9.122)，而雜合型(CT)人群對(duì)宮頸癌患病的危險(xiǎn)性未發(fā)現(xiàn)顯著影響(OR=1.752，95%CI：0.810～3.789)。見表2。

表2 MTHFR基因C677T多態(tài)性與宮頸癌易感性的關(guān)系

2.4血清葉酸和MTHFR基因多態(tài)性相互作用與宮頸癌易感性分析 結(jié)合考慮人群血清葉酸水平和MTHFR基因C677T多態(tài)性相互作用，與宮頸癌易感性的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，在葉酸充足人群中，MTHFR基因型為純合型(TT)的人群患宮頸癌的危險(xiǎn)為2.057倍(95%CI：0.455～9.304)，而葉酸不充足且MTHFR基因型為純合型(TT)的人群患宮頸癌的危險(xiǎn)則上升為4.354倍(95%CI：1.195～15.865)。見表3。

表3 血清葉酸和MTHFR基因多態(tài)性相互作用與宮頸癌易感性的關(guān)系

3 討 論

宮頸癌是僅次于乳腺癌的第二大女性致死癌癥，每年全世界約有50萬新發(fā)病例，死亡人數(shù)超過27萬。國家癌癥中心發(fā)布的研究數(shù)據(jù)表明，我國在2014年宮頸癌患病率居全世界第二。宮頸癌的病因尚未完全明確，葉酸屬于B族維生素，可參與DNA的合成和甲基化。葉酸缺乏則導(dǎo)致DNA甲基化異常和DNA修復(fù)障礙，從而增加腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。最近有研究指出，葉酸缺乏可能與宮頸癌發(fā)生密切相關(guān)，但尚未得出一致的結(jié)論。本研究分別檢測(cè)宮頸癌患者及對(duì)照者血清葉酸水平，發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者血清葉酸水平顯著低于對(duì)照組，與之前報(bào)道一致[4-5]，提示葉酸缺乏可能增加宮頸癌發(fā)生的危險(xiǎn)。

MTHFR是葉酸代謝過程中的關(guān)鍵酶，能不可逆催化N5,N10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為N5-甲基四氫葉酸，為甲基循環(huán)提供供體，維持機(jī)體DNA正常甲基化反應(yīng)，參與DNA合成。MTHFR基因具有單核苷酸多態(tài)性，常見的多態(tài)性位點(diǎn)為C677T，其野生型(CC)可發(fā)生一個(gè)位點(diǎn)突變，為雜合型(CT)，或兩個(gè)位點(diǎn)突變，為純合型(TT)。C677T位點(diǎn)的突變可導(dǎo)致MTHFR發(fā)生酶活性改變，其中雜合型(CT)酶活性只有野生型(CC)的65%，而純合型(TT)的酶活性則只有30%左右。MTHFR酶活性的降低，可導(dǎo)致血清葉酸水平下降，引起DNA甲基化異常和DNA合成障礙，可能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。國內(nèi)外已有研究指出C677T多態(tài)性與乳腺癌、大腸癌、白血病等發(fā)生密切相關(guān)[6-8]。本研究對(duì)宮頸癌患者及對(duì)照組MTHFR基因C677T多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，研究所選的樣本等位基因分布符合H-w平衡，具有群體代表性，在宮頸癌患者中，純合型(TT)所占比例為30.5%，顯著高于對(duì)照組(13.4%)，對(duì)等位基因頻率比較的結(jié)果也顯示，病例組T等位基因頻率高于C等位基因，與對(duì)照組相反，提示MTHFR基因的純合型(TT)是宮頸癌的易感基因，其患宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)較野生型(CC)人群顯著增加(OR=3.485，95%CI：1.331～9.122)，與之前的研究報(bào)道基本一致[9-11]。

有研究認(rèn)為，MTHFR基因C677T多態(tài)性與腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，受血清葉酸水平的影響，存在一定的交互關(guān)系。MTHFR是葉酸代謝過程的關(guān)鍵酶，MTHFR基因發(fā)生突變可導(dǎo)致酶活性下降，從而改變個(gè)體對(duì)腫瘤的遺傳易感性，同時(shí)也引起體內(nèi)葉酸水平的改變。然而，葉酸水平可以通過膳食進(jìn)行補(bǔ)充，在一定程度上降低由于MTHFR基因突變?nèi)巳旱哪[瘤易感風(fēng)險(xiǎn)。因此在考慮MTHFR基因多態(tài)性對(duì)腫瘤的影響時(shí)，必須同時(shí)考慮體內(nèi)實(shí)際葉酸水平，才能正確評(píng)估個(gè)體的遺傳易感性。對(duì)MTHFR基因C677T多態(tài)性與結(jié)直腸癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的研究結(jié)果指出，純合型(TT)的個(gè)體發(fā)生結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)低于雜合型(CT)和野生型(CC)個(gè)體，然而，當(dāng)葉酸水平不足時(shí)，純合型(TT)的保護(hù)作用減弱，甚至可能轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)腸癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加[7]。同樣的，對(duì)MTHFR基因C677T多態(tài)性與乳腺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的研究也認(rèn)為，純合型(TT)攜帶者與乳腺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)的現(xiàn)象僅存在于葉酸不足的婦女當(dāng)中[6]。因此，本研究對(duì)血清葉酸和MTHFR基因多態(tài)性相互作用與宮頸癌易感性進(jìn)行了綜合分析。結(jié)果顯示，在葉酸充足人群中，MTHFR基因型為純合型(TT)的人群患宮頸癌的危險(xiǎn)性較對(duì)照組并無顯著增加，而在葉酸不充足且MTHFR基因型為純合型(TT)的人群中，患宮頸癌的危險(xiǎn)則顯著上升為野生型(CC)的4.354倍(95%CI：1.195～15.865)，提示在存在MTHFR基因突變的個(gè)體中，補(bǔ)充充足的葉酸也有利于降低宮頸癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，與BADIGA等[12]研究結(jié)論基本一致。

4 結(jié) 論

研究結(jié)果表明，MTHFR基因C677T多態(tài)性是宮頸癌發(fā)生的易感因素，該基因的純合型(TT)可增加宮頸癌發(fā)生的危險(xiǎn)，在低葉酸水平的純合型(TT)人群中，發(fā)生宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)最高。由于本研究所納入的研究對(duì)象均已證實(shí)為HPV-16陽性，可排除HPV-16感染對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果的影響。然而，由于條件所限，本研究的樣本量較小，在后期試驗(yàn)中應(yīng)加大樣本量，并納入HPV-16陰性人群進(jìn)行分析研究，進(jìn)一步明確葉酸、MTHFR基因多態(tài)性及HPV-16與宮頸癌的相互關(guān)系。