體外培養(yǎng)法與RNA等溫?cái)U(kuò)增法對(duì)脲原體檢測能力比較

劉亞麗,葉 莎,張文娟，王 潔，劉 暢，陳 雨,甘 勇,李 軍,竇亞玲△,徐英春

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科,北京100730；2.巴州人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,新疆庫爾勒 841000；3.保定市傳染病醫(yī)院檢驗(yàn)科,河北保定071000； 4.河北省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,河北石家莊 050000；5.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院皮膚科,北京100730 )

脲原體為黏膜相關(guān)病原體，主要存在于人體呼吸道及泌尿生殖道黏膜。當(dāng)機(jī)體免疫力低下或接受侵襲性操作時(shí)，脲原體可進(jìn)入血液引起感染甚至播散至其他器官。脲原體可通過直接接觸進(jìn)行傳播，尤其在青春期性活躍健康人群下生殖道中可被分離到。從目前數(shù)據(jù)來看，脲原體可引起男性非衣原體、非淋球菌性尿道炎、急性附睪-睪丸炎、感染性結(jié)石，輸卵管型不孕癥、子宮內(nèi)膜炎，還可引起極低體質(zhì)量兒的下呼吸道感染、先天性肺炎、菌血癥等[1-6]。此外，近期的研究數(shù)據(jù)還顯示，由于脲原體會(huì)降低精液中精子濃度和影響精子活力而導(dǎo)致男性不育[7-10]。目前，針對(duì)脲原體的檢測方法有多種，包括顯微鏡檢查、抗原檢測、血清學(xué)試驗(yàn)、體外培養(yǎng)法、分子生物學(xué)檢測等。其中，體外培養(yǎng)法和分子生物學(xué)檢測在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室中開展較多，且對(duì)臨床指導(dǎo)價(jià)值較大。通過體外培養(yǎng)的方法，24～48 h就可檢出脲原體，且可進(jìn)行半定量和體外藥敏。一般認(rèn)為，當(dāng)男性尿道脲原體數(shù)量>104CFU/mL時(shí)，具有臨床意義[11-13]。分子生物學(xué)方法在對(duì)脲原體進(jìn)行快速檢測的同時(shí)，部分方法還可將微小脲原體和解脲脲原體進(jìn)行很好區(qū)分[14]。雖然，兩種檢測方法在國內(nèi)多家實(shí)驗(yàn)室均有開展，但目前還沒有關(guān)于二者橫向?qū)Ρ鹊难芯?。本研究將培養(yǎng)聯(lián)合測序法作為參考方法，橫向評(píng)估體外培養(yǎng)法和RNA恒溫?cái)U(kuò)增法對(duì)脲原體的檢測能力，從而為臨床診斷和治療提供更有利的指導(dǎo)。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1-8月就診于北京協(xié)和醫(yī)院皮膚性病科、婦產(chǎn)科、泌尿外科等多個(gè)臨床科室，且送檢標(biāo)本為首次尿的患者，共計(jì)103例。

1.2方法

1.2.1采集標(biāo)本 無論男女患者，僅留取清晨首次尿，或長時(shí)間(至少2 h)不排尿后的前段尿0.5 mL。

1.2.2檢測方法 送檢后將標(biāo)本平均分成3份，第1份采用RNA等溫?cái)U(kuò)增法檢測脲原體，第2份采用體外培養(yǎng)法進(jìn)行檢測，第3份采用體外培養(yǎng)聯(lián)合測序法進(jìn)行檢測，即培養(yǎng)結(jié)束后無論陽性陰性均要提取肉湯中核酸，進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增和Sanger法測序。第3份測序的目的:(1)區(qū)分微小脲原體和解脲脲原體;(2)排除細(xì)菌污染可能。

1.2.3觀察指標(biāo) 將體外培養(yǎng)聯(lián)合測序法作為參考方法，RNA恒溫?cái)U(kuò)增法和單純體外培養(yǎng)法作為待評(píng)估方法，分別評(píng)估兩種待評(píng)估方法對(duì)脲原體檢出的靈敏度和特異度。

1.2.4體外培養(yǎng) 采用法國生物梅里埃Mycoplasma IST 2試劑盒進(jìn)行脲原體的檢測，具體操作步驟嚴(yán)格按照廠家說明書完成。藥敏折點(diǎn)：四環(huán)素S≤4.00 μg/mL R≥8.00 μg/mL；多西環(huán)素S≤4.00 μg/mL R≥8.00 μg/mL；克拉霉素S≤1.00 μg/mL R≥4.00 μg/mL；阿奇霉素S≤0.12 μg/mL R≥4.00 μg/mL；紅霉素S≤1.00 μg/mL R≥4.00 μg/mL；交沙霉素S≤2.00 μg/mL R≥8.00 μg/mL；環(huán)丙沙星S≤1.00 μg/mL R≥2.00 μg/mL；氧氟沙星S≤1.00 μg/mL R≥4.00 μg/mL；原始霉素S≤2.00 μg/mL。其中S代表敏感，R代表耐藥。

1.2.5RNA等溫?cái)U(kuò)增法 脲原體核酸檢測采用RNA等溫?cái)U(kuò)增法(上海仁度生物科技有限公司)，以16S rRNA作為靶基因。原理：帶有T7啟動(dòng)子的引物與靶標(biāo)RNA結(jié)合，開始逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；在莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶 (M-MLV RT)RNase H活性作用下，靶標(biāo)RNA鏈降解，形成單鏈cDNA；之后反向引物與cDNA結(jié)合，在M-MLV RT聚合酶活性作用下，產(chǎn)生靶標(biāo)核酸(RNA)的一個(gè)雙鏈DNA拷貝，且該雙鏈帶有T7啟動(dòng)子。在T7 RNA聚合酶作用下，一條DNA雙鏈上產(chǎn)生多個(gè)(100～1 000個(gè))RNA拷貝；每一個(gè)RNA拷貝再從反轉(zhuǎn)錄開始進(jìn)入下一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。采用Roche Light Cycler 480 (美國)主機(jī)擴(kuò)增及Roche Light Cycler 480 Software release 1.5.0 SP4進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.6普通PCR擴(kuò)增與Sanger測序 從體外培養(yǎng)陽性和陰性的肉湯中提取核酸(德國QIAamp MinElute Virus Spin Kit_DNA提取試劑盒)，針對(duì)其脲酶基因進(jìn)行普通PCR 擴(kuò)增。針對(duì)脲原體采用通用引物-脲酶基因(GenBank 登錄號(hào) AF085724和 AF085732),前引物：5′-CGA AAT TGT GAT GAA CGA AGG-3′；后引物：5′-GGT GAT AGC GTT AGA TTA GGA G-3′,418 bp[15]。PCR反應(yīng)體系為30 μL,采用高保真PCR SuperMix Ⅰ (北京天根生物科技有限公司),反應(yīng)條件為94 ℃ 4 min,94 ℃ 1 min,54 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用Sanger測序法測定其序列，引物與PCR擴(kuò)增引物相同。測序結(jié)果分別與GenBank AF085724和AF085732進(jìn)行比對(duì)，僅當(dāng)序列比對(duì)一致率在>99% 時(shí)才被認(rèn)為準(zhǔn)確鑒定到種。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS24.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，3種不同方法對(duì)脲原體進(jìn)行檢測，其檢出率行Pearson′sχ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1患者信息 該研究共收集了103份非重復(fù)尿標(biāo)本，分別來自103例患者，其中男性80例(77.7%)，女性23例(22.3%)，男女構(gòu)成比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。103例患者中，30～<40歲49例(47.57%)，患者人數(shù)最多；其余年齡段患者人數(shù)依次為20～<30歲28例(27.18%)、40～<50歲12例(11.65%)、0～<20歲6例(5.83%)、50～<60歲5例(4.85%)、≥60歲3例(2.91%)。

2.2不同檢測方法測定脲原體結(jié)果比較 基于體外培養(yǎng)聯(lián)合測序的方法，共有24例標(biāo)本 (23.30%) 檢測出了脲原體，其中14例 (17.50%) 分離自男性，10例(43.47%) 分離自女性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.022)。從年齡段來看，40～<50歲脲原體檢出率最高[41.67%(5/12)]；其余年齡段檢出率依次是20～<30歲39.29%(11/28)；30～<40歲16.33%(8/49)；0～<20歲0%(0/6)、50～<60歲0%(0/5)和≥60歲0%(0/3)。如將體外培養(yǎng)聯(lián)合測序法作為參考方法，橫向評(píng)估體外培養(yǎng)法和RNA等溫?cái)U(kuò)增法的靈敏度和特異度，其結(jié)果為體外培養(yǎng)法靈敏度和特異度分別為75.00%(18/24)和100.00%(79/79)；RNA等溫?cái)U(kuò)增法的靈敏度和特異度分別為95.83%(23/24)和96.20%(76/79),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。在體外培養(yǎng)法與RNA等溫?cái)U(kuò)增法結(jié)果不一致的8例標(biāo)本中，全部屬于RNA等溫?cái)U(kuò)增法陽性，體外培養(yǎng)法弱陽性或陰性，經(jīng)培養(yǎng)聯(lián)合測序驗(yàn)證后，有5例(62.5%)證實(shí)存在脲原體。

2.3菌種鑒定 利用PCR聯(lián)合測序的方法，對(duì)24份脲原體檢出陽性標(biāo)本進(jìn)行了菌種鑒定。其中17例(70.83%)為微小脲原體，7例(29.17%)為解脲脲原體，未檢查到二者共同存在的情況。

2.4體外藥敏 18例培養(yǎng)陽性的標(biāo)本進(jìn)行了體外藥敏測定，其中多西環(huán)素、交沙霉素、四環(huán)素、原始霉素敏感率100.00%，克拉霉素、紅霉素和阿奇霉素的敏感率>80.00%，環(huán)丙沙星和氧氟沙星的體外敏感率分別為11.11%和22.22%，見表2。

表1 不同檢測方法測定脲原體結(jié)果比較

注：*表示脲原體數(shù)量小于104CFU/mL為陰性

表2 18例培養(yǎng)陽性脲原體體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果分析(%)

3 討 論

為避免標(biāo)本對(duì)結(jié)果的影響，該研究僅采集清晨尿標(biāo)本，混勻后平均分成3份，分別用3種不同的方法進(jìn)行檢測。此外，為更好地評(píng)估體外培養(yǎng)法和RNA等溫?cái)U(kuò)增法的檢測性能，該研究采用體外培養(yǎng)聯(lián)合測序的方法作為參考方法。因?yàn)閮H通過顏色判斷培養(yǎng)陽性或陰性是不夠準(zhǔn)確的，所以該研究從培養(yǎng)液中提取核酸聯(lián)合PCR擴(kuò)增和測序的方法驗(yàn)證脲原體的真實(shí)性。

當(dāng)橫向評(píng)估體外培養(yǎng)法和RNA等溫?cái)U(kuò)增法時(shí)，雖然二者靈敏度和特異度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但從方法原理來講，RNA等溫?cái)U(kuò)增法的靈敏度相對(duì)較高，體外培養(yǎng)法的特異度稍高。體外培養(yǎng)法有6例培養(yǎng)陰性但參考方法陽性,部分由于培養(yǎng)法通過定量檢測可以排除定植，而核酸檢測則不能以此區(qū)分定植和感染。 在分析RNA等溫?cái)U(kuò)增法時(shí)，發(fā)現(xiàn)有1例屬于參考方法陽性、體外培養(yǎng)法培養(yǎng)液紅色而RNA等溫?cái)U(kuò)增法陰性的標(biāo)本。研究者推測標(biāo)本中可能存在干擾PCR反應(yīng)的物質(zhì)，但具體原因仍不清楚。另外，還有3例屬于RNA等溫?cái)U(kuò)增法陽性而參考方法陰性的情況。這3例均為男性患者，由于門診患者信息資料不全，且相關(guān)檢查不夠完善，已無法查證患者是否有典型的感染癥狀，抑或是無癥狀攜帶。

此外，該研究還對(duì)脲原體的菌種進(jìn)行了進(jìn)一步的鑒定。目前，脲原體分為解脲脲原體和微小脲原體兩種，其中以微小脲原體較常見[12]，與本研究結(jié)果完全相符。有研究表明，解脲脲原體和微小脲原體可同時(shí)存在[6,12]，但該研究未發(fā)現(xiàn)此種情況。另外，體外藥敏結(jié)果顯示，喹諾酮類藥物的耐藥率非常高。目前研究證明，GyrA、GyrB、ParC、ParE序列的改變是導(dǎo)致脲原體對(duì)喹諾酮類藥物耐藥的主要原因，尤其是ParC的 S83L突變最為常見[16-19]。由于機(jī)制研究不是本課題的研究重點(diǎn)，所以會(huì)在后續(xù)研究中進(jìn)行深入探討。

4 結(jié) 論

與體外培養(yǎng)聯(lián)合測序法相比，體外培養(yǎng)法和RNA等溫?cái)U(kuò)增法均表現(xiàn)出了較好的靈敏度和特異度。但從臨床應(yīng)用角度來講，二者聯(lián)合使用可能會(huì)對(duì)脲原體感染的診斷和治療提供更全面的指導(dǎo)。