北京地區(qū)婦科門診患者沙眼衣原體和人類乳頭瘤病毒感染及其基因型相關(guān)分析

洪 萍，王培昌，劉 宇，蘭 賀

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院檢驗科，北京100053)

人類乳頭瘤病毒(HPV)感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的一個重要因素[1-2]。而只有持續(xù)的HPV感染并且存在其他促進(jìn)感染的協(xié)同因素存在時，才有可能引起宮頸癌的發(fā)生，大部分HPV感染都能被宿主的免疫反應(yīng)清除[3]。已有研究表明宮頸癌的發(fā)生與其他的性傳播疾病及HPV有關(guān)，這些性傳播疾病的感染可能是宮頸癌發(fā)生的協(xié)同因素[4-5]。沙眼衣原體(CT)是影響人類生殖健康的重要病原體之一。CT能夠引起前列腺炎和尿道炎等疾病，是引起男性不育的重要原因之一，其抗體存在與否與HPV感染狀態(tài)及宮頸癌的進(jìn)展都有一定的聯(lián)系[3]，婦女感染CT增加了患宮頸癌的風(fēng)險[6]。不同的人種和地區(qū)其HPV感染的基因型分布是有區(qū)別的[7]，目前國內(nèi)關(guān)于CT和HPV感染及HPV基因型相關(guān)研究報道的比較少。本研究對2017年12月至2018年12月首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院婦科門診患者行CT及HPV檢測結(jié)果進(jìn)行了回顧性分析及比較，旨在研究CT和HPV感染及HPV基因型的相關(guān)性，為制定合理的預(yù)防、檢測及治療方案提供依據(jù)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年12月至2017年12月在首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院婦科門診因生殖道感染就診患者1 768 例，平均年齡(30±10)歲，收集患者的相關(guān)臨床信息。納入病例標(biāo)準(zhǔn)：(1)在本院婦科門診因生殖道感染就診患者；(2)HPV分型及CT檢測均在本院進(jìn)行；(3)既往無子宮切除史、宮頸手術(shù)史及HPV感染治療史；(4)無盆腔放射治療史； 排除病例標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者病例資料不完整；(2)月經(jīng)期或嚴(yán)重內(nèi)外科疾病無法配合檢查的患者；(3)標(biāo)本細(xì)胞量過少或標(biāo)本不合格者。

1.2基因分型 (1)單一HPV陽性組根據(jù)HPV是否為單一亞型，分為單一亞型和多重亞型；(2)單一HPV陽性患者根據(jù)HPV基因型，分為不同基因亞型；(3)HPV和CT合并感染患者根據(jù)是否為單一亞型，分為單一亞型和多重亞型；(4)HPV和CT合并感染患者根據(jù)HPV基因型，分為不同基因亞型。

1.3儀器與試劑 CT、HPV核酸檢測試劑盒(廣東潮州凱普生物化學(xué)有限公司)，BIOER lifeExpress 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增儀(杭州博日科技有限公司)，Hybrimax醫(yī)用核酸分子快速雜交儀(廣東潮州凱普生物化學(xué)有限公司)，Lightcycle 480(德國羅氏)。

1.4方法

1.4.1標(biāo)本采集及保存方法 用無菌棉拭子將宮頸口過多的分泌物輕輕擦拭干凈，更換宮頸刷，將其置于宮頸口，輕輕順時針旋轉(zhuǎn)5周，所有標(biāo)本置已加有專用細(xì)胞保存液-液基薄層細(xì)胞學(xué)(TCT)保存液的取樣管內(nèi)，擰緊瓶蓋，立即送檢。

1.4.2DNA提取 取含有宮頸細(xì)胞的細(xì)胞保存液0.6 mL，按照凱普生物化學(xué)有限公司的細(xì)胞裂解液說明書步驟提取DNA。

1.4.3PCR導(dǎo)流雜交HPV分型檢測 (1)PCR擴(kuò)增 ： 按照說明書配置體系并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 每個PCR反應(yīng)孔中加入PCR混合液23.25 μL[含脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、氯化鎂(MgCl2)、Tris-HCl緩沖液]，DNA聚合酶0.75 μL及 DNA樣本1 μL，按說明書配置對應(yīng)空白對照及陽性對照。按照95 ℃/9 min預(yù)變性，95 ℃/20 s變性，55 ℃/30 s退火及72 ℃/30 s延伸，40個循環(huán)。(2)雜交及結(jié)果判定：取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膜雜交，操作按說明書進(jìn)行，結(jié)果出現(xiàn)清晰可見藍(lán)紫色原點為陽性。該試劑盒可檢測21種HPV基因型，其中15種高危型(HR)16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68，6種低危型(LR)6、11、42、43、44，CP8304，并在1 h內(nèi)分析結(jié)果。

1.4.4熒光PCR檢測CT (1)熒光PCR擴(kuò)增：按照說明書進(jìn)行配置體系并進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增。每個PCR反應(yīng)孔中加入PCR混合液17.5 μL(含dNTP、MgCl2、Tris-HCl緩沖液)，DNA聚合酶0.5 μL及 DNA樣本2 μL，按說明書配置對應(yīng)空白對照及陽性對照。按照95 ℃/10 min預(yù)變性，95 ℃/15 s變性，60 ℃/60 s退火及延伸，45個循環(huán)，采集熒光，進(jìn)行Ct值計算。(2)結(jié)果判定:嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，根據(jù)患者Ct值判定陰陽性結(jié)果。當(dāng)臨床樣本的Ct值≤40，判為陽性，否則為陰性。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1HPV和CT檢測結(jié)果 在1 768例婦科門診樣本中，CT陽性者196例，總陽性率為11.1%(196/1 768)。HPV陽性者524例，總陽性率為29.6%(524/1 768)，所有21種HPV基因亞型均有檢出，其中HPV單一亞型者414例(79.0%)，多重亞型者110例(21.0%)。524例HPV陽性樣本中，有122例CT檢測陽性，陽性率23.3%(122/524)。在122例合并感染中，HPV單一亞型者48例(39.3%)，多重亞型者74例(60.7%)。HPV合并CT感染患者多重亞型HPV陽性率明顯高于單一亞型HPV陽性率，而單一HPV感染患者HPV陽性率高于HPV合并CT感染患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同感染類型HPV陽性率分布情況

注：*P<0.05，χ2=175.6，與HPV合并CT感染類型比較；**P<0.05，χ2=150.8,與單一亞型比較

2.2不同感染類型患者HPV的基因型分布情況 122例HPV合并CT感染患者和402例單一HPV感染患者 HPV基因型分布情況見圖1。122例HPV合并CT感染患者共檢測出270個基因型，而402例單HPV感染患者共檢測出474個基因型，感染前4位的HPV基因亞型由高到低依次為HPV-16、52、58、33；各型在HPV合并CT感染患者中陽性率都高于單一HPV 感染患者，見圖1、表2。

圖1 不同感染類型患者HPV基因型分布情況

HPV亞型單一HPV感染HPV合并CT感染χ2P1625(5.3)40(14.8)19.6<0.055222(4.6)36(13.3)18.1<0.055817(3.6)31(11.5)17.8<0.053311(2.3)23(8.5)15.2<0.05合計75(15.8)130(48.1)90.0<0.05

2.3不同感染類型患者單一亞型和多重亞型感染HPV的基因型分布 122例HPV合并CT感染患者和402例單一HPV感染患者單一亞型和多重亞型HPV感染基因型分布見圖2。在單一亞型感染中，HPV合并CT感染患者48例，單一HPV感染患者96例，且單一HPV感染陽性率除HR-HPV 66外，均高于HPV合并CT感染陽性率，見圖2A。在多重亞型感染中，感染前4位的HPV基因亞型由高到低依次為HPV-16、52、58、33，見圖2B；HPV合并CT感染患者多重亞型的陽性率都高于單一HPV感染患者，見表3。

表3 不同感染類型患者單一亞型和多重亞型感染HPV基因型分布[n(%)]

注：A表示單一亞型；B表示多重亞型

圖2 HPV合并CT感染和單一HPV感染患者基因型分布情況

3 討 論

目前文獻(xiàn)報道HPV有近40種亞型跟生殖道感染相關(guān)，根據(jù)誘發(fā)宮頸癌發(fā)生的危險程度的不同，分為HR-HPV和LR-HPV兩大類，且不同HPV亞型的感染其致病性和后果也有差異[8-9]。因而，不同地區(qū)和人群HPV亞型感染的分布資料，是HPV感染和宮頸癌防治策略的基礎(chǔ)。本研究通過對1 768例婦科門診患者進(jìn)行分型篩查，結(jié)果顯示HPV總陽性率為 29.6%(524/1 768)，其中HPV單一亞型者 414例(414/524，79.0%)，多重亞型者110 例(110/524，21.0%)。

HPV的感染已被證實為導(dǎo)致宮頸癌的主要致病因素，但并不是所有HPV感染最終都會演變?yōu)閷m頸癌，CT感染影響宿主自身感染HPV的狀態(tài)也成為導(dǎo)致宮頸癌的一個重要因素[10]。有研究報道，沙眼衣原體的感染可以導(dǎo)致機(jī)體免疫清除能力的減低[3]，從而增加了宿主感染HPV的概率。在本研究中，CT的總陽性率為 11.1%(196/1 768)，而HPV合并CT感染患者為122例(23.3%)，且HPV合并CT患者HPV陽性率明顯高于單一HPV感染患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，該結(jié)果證實CT感染是HPV感染的協(xié)同因素。

在HPV基因型分布的研究中，122例HPV合并CT感染患者中，單一亞型為39.3%(48/122)，多重亞型高達(dá)60.7%(74/122)，共檢測出270各基因型。HPV單一亞型主要分布在單HPV感染的患者中，而HPV合并CT感染患者HPV多重亞型的陽性率明顯高于單一HPV感染患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，該研究結(jié)果表明CT感染有可能會促進(jìn)HPV多重亞型感染的發(fā)生。SERACENI等[11]指出，單一亞型HPV感染一般不會促進(jìn)機(jī)體進(jìn)一步感染的可能，而多重亞型HPV感染可能會導(dǎo)致免疫系統(tǒng)局部損傷。CT感染可能導(dǎo)致HPV多重亞型陽性率升高，對機(jī)體免疫系統(tǒng)造成破壞，最終提高宮頸癌發(fā)生的危險性。本研究發(fā)現(xiàn)，HPV合并CT感染患者的HR-HPV16、52、58、33比單一HPV感染患者總體陽性率更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，多重亞型感染患者與此總體陽性率分布結(jié)果一致。已有文獻(xiàn)報道HR-HPV16在HPV合并CT 感染患者中陽性率最高，CT感染有可能提高HPV16在低度鱗狀上皮內(nèi)病變的蛋白表達(dá)，提高HPV的活性[3,12]。因此，CT感染會增加HPV多重感染的風(fēng)險，從而提高HPV合并CT感染著宮頸癌變的風(fēng)險。

4 結(jié) 論

從CT感染患者中HPV尤其多重亞型及HR-HPV高陽性率了解到對于檢測出HPV感染的婦女，有必要進(jìn)行CT的檢測，若兩者均為陽性，臨床應(yīng)予以重視，并進(jìn)行及時針對性治療，從而更好的防治HPV感染和宮頸癌的發(fā)生。