Aiolos基因多態(tài)性與貴州漢族人群系統(tǒng)性紅斑狼瘡的相關(guān)性*

楊瑩， 楊英， 陳曉紅△， 陳林， 梁翰月， 羅麗， 賈常莎， 陳永艷， 晏文

1遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科 (貴州遵義 563000)； 2遵義醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院皮膚科(貴州遵義 563000)； 3遵義市第一人民醫(yī)院皮膚科(貴州遵義 563002)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是一種多基因的疾病，多種基因表達(dá)的異常導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞和(或)調(diào)節(jié)細(xì)胞如T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞功能失調(diào)，促使B細(xì)胞產(chǎn)生病理性自身抗體[1-4]。SLE遺傳發(fā)病機(jī)制中其發(fā)病率和患病率在不同地區(qū)、種族有很大差異。Aiolos基因(IKZF3)基因位于染色體17q21區(qū)域，其編碼的Aiolos蛋白是鋅指蛋白家族的成員，對T、B淋巴細(xì)胞以及自然殺傷細(xì)胞的發(fā)育具有重要作用。近年來，Aiolos基因被發(fā)現(xiàn)是多種免疫相關(guān)疾病的候選基因[5-7]。目前一些研究提示Aiolos基因多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)可能與SLE有關(guān)[8]。為研究貴州漢族人群Aiolos基因多態(tài)性與SLE相關(guān)性，我們選擇Aiolos基因rs9909593、rs9635726及rs12150079 3個SNP位點(diǎn)，利用SNaPshot法對其進(jìn)行基因分型，探討其與SLE發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取SLE患者213例(SLE組)，來自遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2014年10月至2017年10月就診的門診和住院患者，其中男16例，女197例,年齡8～68歲，平均(32.93±12.15)歲。所有納入研究對象均符合1997年美國風(fēng)濕病學(xué)會修訂的SLE分類和診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。187例健康對照組為同一時期在我院體檢的正常健康人群，其中男16例，女171例，年齡12～69歲，平均(33.48±10.61)歲。兩組年齡、性別構(gòu)成差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，且其一、二、三級親屬中均無SLE患者。所有納入對象均為貴州漢族人，無親緣關(guān)系，無近期有感染及其他免疫性疾病。本研究獲本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有的研究對象均簽署知情同意書。

1.2 SNP位點(diǎn)選擇 根據(jù)HapMap dbSNP數(shù)據(jù)庫(www．hapmap．ncbi．nlm．nih．Gov)及查閱相關(guān)文獻(xiàn)，我們選擇標(biāo)簽SNP(rs9909593、rs9635726、rs12150079)納入本研究，3個SNP位點(diǎn)均滿足：(1)選擇SLE有相關(guān)性的單核苷酸多態(tài)性；(2)位點(diǎn)在中國人群的最小等位基因頻率(MAF)均>0．05。

1.3 實驗步驟

1.3.1 標(biāo)本采集及基因組DNA提取 采集SLE患者及健康對照者外周靜脈血2 mL置于乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)真空抗凝管中，根據(jù)Magen DNA提取試劑盒說明書提取白細(xì)胞基因組DNA，并標(biāo)記置于-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 SNaPshot基因分型

1.3.2.1 PCR擴(kuò)增引物及SNaPshot引物設(shè)計及合成 參照GenBank中Aiolos基因的引物序列查找Aiolos基因rs9909593、rs9635726、rs12150079 3個位點(diǎn)的引物序列，運(yùn)用primer5.0設(shè)計引物，由北京六合華大基因科技有限公司合成提供，見表1～2。

1.3.2.2 多重PCR PCR反應(yīng)體積為30 μL，包括10×DNA聚合酶緩沖液3 μL，dNTP 2 μL，基因組DNA 2 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，引物混合1 μL，H2O 20.8 μL。多重PCR擴(kuò)增條件為96℃預(yù)變性2 min，96℃變性20 s，54℃退火10 s，72℃延伸30 s，反應(yīng)35個循環(huán)，再次72℃延伸2 min，4℃保存。

1.3.2.3 PCR產(chǎn)物純化 采用美國ABI公司生產(chǎn)的SAP和Exo Ⅰ進(jìn)行。反應(yīng)體系為8 μL，其中PCR產(chǎn)物為6 μL，酶混合液2 μL(含2U SAP和2U Exo Ⅰ)；反應(yīng)條件：37℃孵育保溫1 h，然后75℃保溫15 min以滅活SAP和Exo Ⅰ酶，純化好后進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，預(yù)先混好延伸引物。

表1 PCR 擴(kuò)增引物

F:正向擴(kuò)增引物；R:反向擴(kuò)增引物

表2 SNaPshot單堿基延伸引物

1.3.2.4 SNaPshot反應(yīng) 采用美國ABI公司生產(chǎn)的ABI PRISM SNaPshot Muhiplex Kit進(jìn)行。反應(yīng)體系為5 μL，其中PCR產(chǎn)物為3 μL，SNaPshot Mix 0.5 μL，延伸引物混合1 μL；反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2 min，95℃變性10 s，50℃退火5 s，60 ℃延伸30 s，反應(yīng)35個循環(huán)，12℃保存。

1.3.2.5 SNaPshot反應(yīng)產(chǎn)物純化 SNaPshot延伸產(chǎn)物用SAP純化。在5 μL上述SNaPshot PCR產(chǎn)物中加入0.5 U SAP，震蕩混勻，37℃保溫1 h，75℃保溫15 min以滅活SAP，4℃可保存24 h 或-20℃長期保存。

1.3.2.6 采用ABI 3730XL測序儀測序分型產(chǎn)物 取1 μL SNaPshot延伸產(chǎn)物，加入Hi-Di Formamide 6.5 μL、GS-120LIZ 0.5 μL，上機(jī)經(jīng)ABI 3730XL檢測，使用GENEMarker軟件分析峰圖結(jié)果。為保證分型的準(zhǔn)確度，隨機(jī)挑選8例樣本進(jìn)行雙向測序，均未發(fā)現(xiàn)分型錯誤。3個位點(diǎn)的分型成功率為98%。測序與基因分型由北京六合華大基因科技有限公司完成。

1.3.2.7 連鎖不平衡和單體型分析 利用SHEsis 軟件對Aiolos基因rs9909593、rs9635726、rs12150079 3個位點(diǎn)SNP進(jìn)行連鎖不平衡和單體型分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 所有的SNP分型數(shù)據(jù)質(zhì)控、等位基因和基因型分布頻率比較采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。SLE組和健康對照組分別進(jìn)行Hard-Weinberg遺傳平衡檢驗。各等位基因和基因型個數(shù)采用直接計數(shù)法計算，多態(tài)性位點(diǎn)各等位基因和基因型分布頻率比較用2檢驗，并計算等位基因相對危險度的比值比(OR值)及其95%可信區(qū)間(95%CI)，采用非條件logistic回歸模型分析等位基因的在多個遺傳模型(加性、隱性、顯性)下基因與疾病易感性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。連鎖不平衡和單體型分析采用SHEsis在線軟件進(jìn)行處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樣本及SNP質(zhì)控 SNaPshot延伸反應(yīng)：產(chǎn)物經(jīng)ABI 3730XL掃描，結(jié)果顯示400個樣本均獲得良好的分型結(jié)果。Aiolos rs9909593、rs9635726及rs12150079這3個位點(diǎn)在SLE組和健康對照組中的基因型頻率進(jìn)行Hard-Weinberg遺傳平衡檢驗，結(jié)果顯示所有位點(diǎn)均符合Hard-Weinberg遺傳平衡定律(P>0.05)，說明樣本具有群體代表性，見表3。

2.2 SNaPshot PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果 Aiolos rs9909593、rs9635726及rs12150079位點(diǎn)基因型擴(kuò)增產(chǎn)物測序圖分別見圖1～3。通過峰的顏色判斷堿基類型，通過峰的數(shù)量判斷雜合還是純合。其中藍(lán)色、綠色、紅色、黑色峰分別代表G、A、T和C堿基，單峰表現(xiàn)為純合子，雙峰表現(xiàn)為雜合子。

2.3 Aiolos 3個SNP位點(diǎn)基因型頻率、等位基因頻率分布及遺傳模式分析 檢測的Aiolos rs9909593、rs9635726及rs12150079 SNP位點(diǎn)中基因型頻率和等位基因頻率的分布在SLE組與健康對照組間，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；對上述3個SNP采用非條件logistic回歸模型分析等位基因的在多個遺傳模式(加性、隱性、顯性)下進(jìn)行不同遺傳模型分析結(jié)果顯示，在SLE組與健康對照組間，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

2.4 連鎖不平衡檢驗和單體型分析 對rs9909593、rs9635726、rs12150079這3個SNP 進(jìn)行兩兩間連鎖不平衡檢驗，rs9909593與rs12150079、rs9635726與rs12150079存在完全連鎖不平衡，rs9635726與rs9909593存在強(qiáng)連鎖不平衡，見表5、圖4～5。本研究采用SHEsis在線軟件進(jìn)行單體型種類和單體型頻率的估計，以最低頻率的閾值，即單體型頻率<0.03的不納入分析范圍的標(biāo)準(zhǔn)，Aiolos基因rs12150079、rs9635726、rs9909593共3個位點(diǎn)可構(gòu)建5種單體型(ACG、GCA、GCG、GTA、GTG)，在SLE組與健康對照組中的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，同時非條件logistic回歸分析顯示，各單體型與SLE發(fā)病均無關(guān)，見表5。

表3 Aiolos基因3個SNP位點(diǎn)基因型分布的Hardy-Weinberg平衡檢驗 例(%)

圖1 rs9909593 測序結(jié)果

圖2 rs9635726測序結(jié)果

圖3 rs12150079 測序結(jié)果

表5 Aiolos基因3個SNP位點(diǎn)連鎖不平衡分析(r2/D′)

D′:連鎖不平衡系數(shù)；r2：相關(guān)系數(shù)

3 討論

Aiolos基因(IKZF3)作為IKaros家族的成員，位于17q21區(qū)域處于很強(qiáng)的連鎖不平衡狀態(tài)，參與淋巴細(xì)胞發(fā)育、分化、功能維持及凋亡的調(diào)控，是淋巴細(xì)胞發(fā)育必要的細(xì)胞因子[10]。一些研究表明，17q21

圖4 SLE組連鎖不平衡D′值

區(qū)域基因多態(tài)性與強(qiáng)直性脊柱炎、SLE、哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等的發(fā)生顯著相關(guān)，因此該區(qū)域很可能是多種自身免疫病的易感區(qū)域[11]。近年來通過全基因組關(guān)聯(lián)分析，IKZF1基因的rs2366293、rs1456896及Aiolos基因的rs9913957、rs8076347、rs8079075、rs907091、rs12150079[12-15]等位點(diǎn)在不同人群中發(fā)現(xiàn)與SLE具有相關(guān)性。我們早先對SLE患者Aiolos基因mRNA及蛋白表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者Aiolos基因的mRNA及蛋白明顯降低，且與SLE活動指數(shù)呈一定的相關(guān)性[16-17]。提示Aiolos基因的表達(dá)與SLE相關(guān)，因此，我們通過研究貴州漢族人群SLE患者Aiolos的多態(tài)性，進(jìn)一步認(rèn)識Aiolos基因與SLE的關(guān)系，同時也為分子水平診治SLE提供一定的理論依據(jù)。

越來越多的證據(jù)表明Aiolos基因在SLE 發(fā)病機(jī)制中有重要作用，與其他自身免疫病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等易感性也相關(guān)。美國近年的一項多種族全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)研究[18]提示Aiolos基因中的rs8079075、rs9913957、 rs8076347 與歐洲SLE和非裔美國SLE均具有相關(guān)性，在亞洲人群中未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點(diǎn)，本研究我們也選取了上述3個SNP位點(diǎn)進(jìn)行重測序，均未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點(diǎn)。本研究我們首次對貴州漢族人群Aiolos rs9909593、rs9635726及rs12150079位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分析，結(jié)果顯示貴州漢族SLE 患者這3個SNP位點(diǎn)基因型和等位基因頻率與正常健康人群差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，在多個遺傳模式(加性、隱性、顯性)下，利用logistic回歸模型分析顯示兩組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；聯(lián)合基因型進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，rs12150079與rs9635726、rs9909593存在完全連鎖不平衡，rs9635726與rs9909593存在強(qiáng)連鎖不平衡，5單體型(ACG、GCA、GCG、GTA、GTG)頻率在SLE組及健康對照組中的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，同時非條件logistic回歸分析顯示，各單體型與SLE發(fā)病均無關(guān)。在葉麗霞等[19]研究中發(fā)現(xiàn)了rs9909593、rs9635726位點(diǎn)與SLE存在關(guān)聯(lián)，與本研究結(jié)果不一致；Cai等[20]研究中rs12150079位點(diǎn)與SLE不存在關(guān)聯(lián)，與本研究結(jié)果一致。

本研究我們只選取了3個標(biāo)簽SNPs，不能完全代表Aiolos基因。雖然本研究并未發(fā)現(xiàn)上述3個標(biāo)簽SNPs與貴州漢族SLE疾病有相關(guān)性，但不能完全排除Aiolos基因與中國漢族SLE疾病的相關(guān)性，仍需全面研究該基因的遺傳變異，還需要進(jìn)一步對Aiolos基因其他多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行全面分析，從而深入探索Aiolos基因與中國漢族SLE疾病的關(guān)系。由于本研究的選取SNP位點(diǎn)及研究對象數(shù)較少，僅對單個位點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析研究，基因-基因交互作用研究仍有待進(jìn)一步開展，結(jié)果仍需今后進(jìn)一步在不同地區(qū)、不同民族以及大樣本人群中進(jìn)一步驗證。