江西農(nóng)村與城鎮(zhèn)耐藥結(jié)核分枝桿菌分子特征的比較*

熊光初， 陳嬙， 章琪， 羅東， 劉濤， 彭亦平， 陳開森△

江西省胸科醫(yī)院 1檢驗科， 3呼吸科(江西南昌 330006)； 2南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科 (江西南昌 330006)

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tuberculosis, TB)是重要的傳染性病原體，其導(dǎo)致的結(jié)核病(tuberculosis)仍然是重要的公共健康問題。據(jù)中國2010年結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查[1]，我國結(jié)核病分布表現(xiàn)為西部高于東部，農(nóng)村高于城鎮(zhèn)人群的特點(diǎn)。江西省處于我國的中東部地區(qū)，經(jīng)濟(jì)發(fā)展欠發(fā)達(dá)，農(nóng)村與城鎮(zhèn)發(fā)展不平衡，了解農(nóng)村及城鎮(zhèn)患者結(jié)核菌的分子特征，特別是耐藥結(jié)核菌，其結(jié)果對于針對性地制定結(jié)核的防控措施具有重要價值。目前結(jié)核菌分子流行病學(xué)研究方法較多[2]。結(jié)核分枝桿菌多位點(diǎn)數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列(MIRU-VNTRs)因其操作容易、結(jié)果穩(wěn)定及實驗室間易于比較常被采用。本研究對我院近年來分離的371株耐藥結(jié)核菌進(jìn)行15位點(diǎn)MIRU-VNTRs分型研究，旨在了解江西省不同來源耐藥菌株的分子特征；同時采用RD105基因缺失鑒定為北京基因型[3-4]，為了解江西省不同來源耐藥結(jié)核菌的耐藥方式和分子特征，及后續(xù)防控方法提供基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 收集江西省胸科醫(yī)院2014年1月至2017年12月住院患者371株痰培養(yǎng)耐藥結(jié)核菌，所有結(jié)核菌培養(yǎng)均采用L-J培養(yǎng)基。標(biāo)準(zhǔn)結(jié)核菌株H37Rv為實驗室自留，由中國CDC參比實驗室提供。實驗前菌株-80℃保存。

1.2 藥敏實驗 培養(yǎng)陽性的結(jié)核菌做一線結(jié)核藥敏試驗，包括異煙肼(INH)、利福平(RIF)、乙胺丁醇(EMB)和鏈霉素(SM)，檢測方法為絕對濃度法。藥物濃度及結(jié)果判斷參照文獻(xiàn)[3]。

1.3 北京家族菌 采用多重PCR技術(shù)，北京家族菌株表現(xiàn)為特征性的RD105片段缺失。模板提取、引物設(shè)計、PCR反應(yīng)條件及結(jié)果判讀參照文獻(xiàn)[3]。

1.4 基因分型 本研究采用15位點(diǎn)MIRU-VNTRs，各位點(diǎn)引物、各位點(diǎn)的反應(yīng)條件及結(jié)果判讀參照文獻(xiàn)[5]。

1.5 結(jié)果分析 非北京家族擴(kuò)增產(chǎn)物為1 466 bp，而北京家族菌株的擴(kuò)增產(chǎn)物為761 bp。MIRU-VNTRs各位點(diǎn)電泳結(jié)果換算成重復(fù)數(shù)如文獻(xiàn)報道[5]，各位點(diǎn)分辨率計算及多態(tài)性程度判斷見文獻(xiàn)[6]。簇的定義及近期感染最小估計值的界定參照文獻(xiàn)[3]。

2 結(jié)果

2.1 基本情況 371株菌中，農(nóng)村戶籍患者294株，城鎮(zhèn)戶籍患者77株，所有菌株都對至少一種一線抗結(jié)核藥物耐藥，耐藥方式見表1。

表1 江西耐藥結(jié)核患者藥敏結(jié)果 株

2.2 北京家族菌株 本研究共分離到北京家族菌318株，非北京家族菌54株，北京家族菌為85.71%(318/371)，其中農(nóng)村患者為86.05%(253/294)，城鎮(zhèn)患者為84.42%(65/77)。

2.3 聚類分析 參照www.miru-vntrplus.org提供的方法，371株菌共計分33個簇及279個孤立株，其中完全由農(nóng)村患者構(gòu)成23個簇，完全由城鎮(zhèn)患者構(gòu)成7個簇，即包括農(nóng)村又包括城鎮(zhèn)患者13個簇。

2.4 位點(diǎn)多態(tài)性 農(nóng)村來源菌株中，高度分辨率位點(diǎn)為MIRU26和Mtub04；中度分辨率位點(diǎn)為MIRU10、Qub11b、Qub26和MIRU16；低度分辨率位點(diǎn)為ETRE、Mtub39、Mtub30、ETRA、ETRD、MIRU40、Qub4156、Mtub30和ETRC。城鎮(zhèn)來源菌株中，高度分辨率位點(diǎn)為MIRU26和Qub26；中度分辨率位點(diǎn)為MIRU10和Mtub04；低度分辨率位點(diǎn)為ETRC、ETRD、MIRU40、MIRU16、Mtub21、Qub11b、ETRA、Mtub30、ETRE、Mtub39和Qub4156。不同來源菌株間位點(diǎn)分辨率的結(jié)果見表2。

2.5 近期感染最小估計值 農(nóng)村人員近期感染傳播率為18.03%，城鎮(zhèn)人員近期傳播率為15.58%，兩者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

本研究收集了我院近年來耐藥非重復(fù)結(jié)核菌371株，由于該院患者來源于全省各地，故菌株的分子特征可代表江西耐藥結(jié)核菌的分子特征。

中國是全球5個主要耐藥結(jié)核高負(fù)擔(dān)國家之一，2017年WHO結(jié)核報告顯示我們耐藥結(jié)核菌已經(jīng)超過印度，處于第1位。據(jù)2010年衛(wèi)生部公布的《全國結(jié)核病耐藥基線調(diào)查報告》，我國涂陽肺結(jié)核患者結(jié)核菌耐藥率高達(dá)43.8%[7]，據(jù)此估算，我國每年新發(fā)耐藥結(jié)核患者56.0萬[1]。另據(jù)近年江西省有關(guān)結(jié)核菌的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果：江西地區(qū)耐藥結(jié)核菌分離率高于全國平均水平[8]。參照近年來江西省人口數(shù)量、人群分布、結(jié)核菌分離率及耐藥狀況，江西地區(qū)耐藥結(jié)核人群總數(shù)保有量估計超過10萬人。了解這些患者結(jié)核菌的來源、耐藥模式及分子特征對江西地區(qū)結(jié)核的控制及預(yù)防具有重要意義。

近年我院耐藥結(jié)核菌的人群資料表明，感染患者主要來源于農(nóng)村，城鎮(zhèn)戶籍人口明顯少于農(nóng)村，這與江西是農(nóng)業(yè)大省有關(guān)。耐藥模式表明農(nóng)村地區(qū)耐單藥結(jié)核菌107株、耐2藥結(jié)核菌87株及耐3藥結(jié)核菌97株，城鎮(zhèn)地區(qū)則分別為27、29和30株，結(jié)果表明江西地區(qū)結(jié)核耐藥患者耐多藥常見，甚至出現(xiàn)4株菌對4種一線抗結(jié)核藥物耐藥，耐藥率高的部分原因可能是我院為結(jié)核病治療的上級醫(yī)院，多為復(fù)治或治療失敗患者[8]。

表2 371株菌的各位點(diǎn)遺傳差異及分辨指數(shù) 菌株數(shù)

分子流行病學(xué)已廣泛用于結(jié)核菌的近期傳播調(diào)查，其原理是某一地區(qū)短時間內(nèi)(通常3年)結(jié)核菌具有相同分子標(biāo)識，則認(rèn)為相互間可能具有傳播關(guān)系，本研究采用國際通用的15位點(diǎn)MIRU-VNTRs分型分析這些耐藥菌株。結(jié)果顯示：HGDI值較高，表明具有高的分辨率，表明15位點(diǎn)MIRU-VNTRs對本地區(qū)耐藥結(jié)核菌可以很好地定義菌株間傳播關(guān)系。多種研究表明北京家族菌是我國主要的流行株，本結(jié)果也表明江西地區(qū)流行結(jié)核菌也以北京基因型菌株為主且高于周邊地區(qū)，例如湖南、浙江及福建[9]。有研究認(rèn)為經(jīng)典的15位點(diǎn)MIRU-VNTRs對北京家族菌株分辨率較低，然而另有研究認(rèn)為該位點(diǎn)組合分型技術(shù)可用于北京基因型的分型研究[10]。我們的分型結(jié)果表明，雖然各個位點(diǎn)的分辨率存在較大差異，但總分辨率為0.996 4。

基因分型的意義是調(diào)查菌株間是否存在近期傳播關(guān)系。感染者具有相同的基因型提示患者可能是近期被同一傳染源所感染；單一基因型表提示患者可能是內(nèi)源性復(fù)燃而導(dǎo)致。本次研究中371菌株的成簇率為28.64%，高于Liu等[11]研究結(jié)果。雖然MIRU-VNTR分型研究的基礎(chǔ)是感染菌株間具有相同的基因型，但具有相同基因型的結(jié)核菌可能并沒有流行病學(xué)聯(lián)系，且全基因組測序分析也證明了MIRU-VNTR分型技術(shù)增高患者間感染在結(jié)核病發(fā)生中的作用[12]。根據(jù)農(nóng)村及城鎮(zhèn)患者來源菌株的比較研究，發(fā)現(xiàn)僅農(nóng)村結(jié)核間的傳播率(18.03%)幾乎等同于僅城鎮(zhèn)結(jié)核間的傳播率(15.58%)，表明兩類人群間無差異。由于低成簇率，故認(rèn)為江西地區(qū)患者耐藥結(jié)核菌感染以復(fù)燃為主，故治療中應(yīng)增大患者藥物使用的依從性。總之，江西省耐藥結(jié)核患者較多，感染以復(fù)燃為主，在人群的防治中，應(yīng)盡可能地發(fā)現(xiàn)傳染源并采取多種措施控制傳播的發(fā)生。