注射途徑對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在器官移植受體內(nèi)分布的影響*

龔勇泉， 曹健斌， 韋成信， 李富驪， 黃維佳， 何凌云， 農(nóng)巍， 伍義文， 羅鵬

柳州市人民醫(yī)院心胸血管外科(廣西柳州 545003)

研究不同途徑注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)后該細(xì)胞在器官移植受體內(nèi)的分布和存活規(guī)律，有利于合理應(yīng)用該細(xì)胞調(diào)節(jié)器官移植免疫排斥反應(yīng)，在臨床上有重要的意義。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs能減輕心臟移植排斥反應(yīng)，動(dòng)脈途徑注射BMSCs比靜脈注射途徑能更加顯著延長(zhǎng)移植心臟的存活時(shí)間，我們分析原因可能是BMSCs在體內(nèi)的分布不同所致。對(duì)此， 2016年1—6月，我們進(jìn)行了本研究課題，研究了BMSCs不同途徑注射后在器官移植受體內(nèi)的分布，我們將體外培養(yǎng)的綠色熒光(enhanced green flurorescent protein, eGFP)BMSCs(eGFP-BMSCs)，經(jīng)移植心臟物右心室腔內(nèi)、升主動(dòng)脈兩種途徑注射到小鼠體內(nèi)，對(duì)比觀察了細(xì)胞在心臟移植受體內(nèi)心臟移植物、肺臟以及肝臟分布和存活規(guī)律，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)近交系C57小鼠，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，共48只(n=48)，周齡6～8周，體重16～24 g。eGFP轉(zhuǎn)基因C57小鼠購(gòu)于南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院。實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物的使用嚴(yán)格遵守柳州市人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用管理規(guī)定。

1.2 eGFP-BMSCs的培養(yǎng) 雄性eGFP-C57小鼠，斷頸處死，無(wú)菌條件下取出股骨和脛骨，去除周圍附著的軟組織，將骨頭移入干凈的盛有2%FBS-PBS培養(yǎng)皿中，并放置于冰上。分別切除股骨和脛骨的兩端，用2%FBS-PBS反復(fù)沖洗骨髓腔直至沖洗液顏色蒼白，收集沖洗液，70 μm濾網(wǎng)過濾，1 200 r/min離心5 min，棄上清，小心吹打制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，2×106個(gè)接種于10 cm培養(yǎng)皿中，加入小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(stemcell technilogies)10 mL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后換液除去非貼壁細(xì)胞，此后每2～3 d換液1次，在細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)應(yīng)用0.25%胰酶消化傳代，傳至第3代時(shí)，細(xì)胞可以開始用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。取生長(zhǎng)良好的第3代細(xì)胞，胰酶消化后，分別加入熒光標(biāo)記抗體CD29、CD44、CD34單克隆抗體，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志表達(dá)。

1.3 小鼠頸部心臟移植模型的建立以及動(dòng)物分組 使用單人雙目手術(shù)顯微鏡(啟航光學(xué)儀器鳳凰顯微鏡)，放大16倍，麻醉采用腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg)和甲苯噻嗪(25 mg/kg)的混合液(購(gòu)于柳州市人民醫(yī)院藥劑科)，移植術(shù)前12 h動(dòng)物禁食但不禁水。供體手術(shù)：小鼠麻醉成功后，手術(shù)部位備皮，將小鼠仰臥固定于自制的手術(shù)板上，正中腹部剪開，暴露下腔靜脈，注入4℃肝素生理鹽水1 mL(肝素濃度100 U/mL)，等待1 min后橫斷腹主動(dòng)脈和下腔靜脈全身放血，延長(zhǎng)切口，暴露心臟，局部冰泥降溫，游離上腔靜脈以及下腔靜脈并結(jié)扎離斷，盡量靠近無(wú)名動(dòng)脈離斷升主動(dòng)脈，游離肺動(dòng)脈主干，盡可能靠近肺動(dòng)脈分叉處離斷，6-0絲線一次集束結(jié)扎左右肺靜脈、左上腔靜脈，在結(jié)扎線遠(yuǎn)心端剪斷，取出供心，置于預(yù)冷的生理鹽水中保存。受體手術(shù)：麻醉成功后小鼠頸部備皮，右側(cè)頸部作一反“L”形切口，切除右側(cè)下頜腺，游離右側(cè)頸外靜脈，切除部分右側(cè)胸鎖乳突肌，顯露并游離右側(cè)頸總動(dòng)脈，6-0絲線結(jié)扎阻斷血管，使用10-0尼龍線將供體升主動(dòng)脈與受體頸總動(dòng)脈行端側(cè)吻合，供體肺動(dòng)脈與受體頸外靜脈行對(duì)端吻合，先后開放頸外靜脈和頸總動(dòng)脈近心端阻斷線，頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端阻斷線保持結(jié)扎狀態(tài)，可見血管充盈良好，心臟立即開始跳動(dòng)。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組以及細(xì)胞移植的方法 心臟移植手術(shù)成功后，受體小鼠隨機(jī)分為A組和B組，每組12只。A組為動(dòng)脈途徑干細(xì)胞移植組，在移植心臟跳動(dòng)后立即經(jīng)過移植心臟升主動(dòng)脈注射eGFP-BMSCs懸液30 μL(含1×106細(xì)胞)；B組為靜脈途徑干細(xì)胞移植組，同樣時(shí)間點(diǎn)經(jīng)過移植心臟右心室腔內(nèi)注射相同劑量細(xì)胞懸液，注射完畢后使用棉簽壓迫注射針眼止血，確認(rèn)無(wú)出血后縫合皮膚切口，手術(shù)后小鼠單籠喂養(yǎng)，觀察小鼠存活的情況。

1.5 病理學(xué)檢測(cè) 分別在移植后1、3、7、14 d不同時(shí)間點(diǎn)處死兩組小鼠，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組各處死3只小鼠。切取移植心臟、肺以及肝組織，OCT包埋后冰凍切片，在40倍熒光顯微鏡下觀察eGFP-BMSCs細(xì)胞在各組織中的存活情況。隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野中綠色熒光細(xì)胞的平均數(shù)目，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的綠色熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)取3只小鼠計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值。

2 結(jié)果

2.1 eGFP-BMSCs細(xì)胞的培養(yǎng) 體外培養(yǎng)eGFP-BMSCs生長(zhǎng)良好，24 h能貼壁生長(zhǎng)，48 h細(xì)胞明顯增多，形態(tài)呈梭狀、星形(圖1)。細(xì)胞傳至第7代時(shí)，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞仍呈較強(qiáng)的綠色熒光表達(dá)(圖2)。使用流式細(xì)胞檢測(cè)培養(yǎng)的第3代BMSCs，發(fā)現(xiàn)CD29陽(yáng)性細(xì)胞達(dá)到99%，CD44陽(yáng)性細(xì)胞達(dá)到99%，CD34陽(yáng)性細(xì)胞達(dá)到98%，見圖3。

圖1 第3代eGFP-BMSCs細(xì)胞形態(tài)(×40)

圖2 第7代eGFP-BMSCs(×40)

2.2 心臟移植以及細(xì)胞移植后的結(jié)果 小鼠頸部心臟移植共進(jìn)行24例，移植心臟均跳動(dòng)良好，手術(shù)未見死亡。細(xì)胞移植后小鼠耐受良好，無(wú)干細(xì)胞移植后動(dòng)物死亡。術(shù)后小鼠存活良好，頸部觸診心臟移植物均跳動(dòng)良好。

2.3 細(xì)胞在移植心臟、肺以及肝臟內(nèi)的存活情況 移植后第1天，A組和B組綠色熒光細(xì)胞主要分布于心臟移植物和肺，肝臟內(nèi)未發(fā)現(xiàn)綠色熒光細(xì)胞，但是A組心臟移植物內(nèi)的熒光細(xì)胞數(shù)明顯多于B組，而肺內(nèi)明顯少于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。術(shù)后3 d，兩組心臟移植物內(nèi)的綠色熒光細(xì)胞對(duì)比術(shù)后第1天均減少，但A組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，B組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組肺內(nèi)的綠色熒光細(xì)胞對(duì)比術(shù)后第1天減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。術(shù)后第3天，A組與B組之間相比，心臟移植物內(nèi)的綠色熒光細(xì)胞數(shù)，A組仍大大超過B組，而肺內(nèi)綠色熒光細(xì)胞數(shù)A組小于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。細(xì)胞移植后第3天肝臟內(nèi)可見綠色熒光細(xì)胞。移植術(shù)后第7天，僅A組的心臟移植物內(nèi)有熒光細(xì)胞存在，A組的肺組織和肝臟以及B組的心臟移植物以及肝臟和肺內(nèi)均未見綠色熒光細(xì)胞。移植術(shù)后第14天，兩組的心臟移植物、肺和肝臟均未見細(xì)胞存活的跡象(圖4～6)。

圖3 流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志

3 討論

應(yīng)用BMSCs減輕器官移植排斥反應(yīng)具有重要的臨床應(yīng)用前景[1-3]，研究不同注射途徑移植干細(xì)胞后細(xì)胞在體內(nèi)的分布和存活規(guī)律，能為干細(xì)胞在臨床器官移植領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)，具有重要的意義[4]。

表1 兩組不同組織中eGFP-BMSCs數(shù)目的比較個(gè)

與第1天比較*P<0.05，**P<0.01；△與B組同時(shí)間比較P<0.01

干細(xì)胞常用的移植方法有靜脈注射和動(dòng)脈注射。由于小鼠的靜脈細(xì)，經(jīng)尾靜脈或者陰莖背靜脈注射干細(xì)胞難度非常高[5]，容易引起實(shí)驗(yàn)誤差。我們的實(shí)驗(yàn)使用移植心臟右心室腔內(nèi)注射的方法替代靜脈注射的方法，細(xì)胞注入移植心臟右心室后順血流方向回流進(jìn)入肺動(dòng)脈，通過供體的肺動(dòng)脈和受體的頸外靜脈吻合口，血液回流到受體的頸外靜脈[6]，該方法與靜脈注射方法效果相同，而且在顯微鏡下該方法操作簡(jiǎn)單易行，顯微鏡直視下可以確保注射器針頭在右心室腔內(nèi)而不是心肌壁，注射細(xì)胞前回抽注射器，回抽有血，也可確認(rèn)注射器針頭在右心室心腔內(nèi)。動(dòng)脈注射的方法我們采用經(jīng)過移植心臟升主動(dòng)脈注射，細(xì)胞順血流方向，進(jìn)入移植心臟的冠脈系統(tǒng)，隨后進(jìn)入移植心臟微循環(huán)，該方法與動(dòng)脈注射效果相同。

圖4 熒光顯微鏡下A組和B組肺內(nèi)綠色熒光細(xì)胞表達(dá)的典型冰凍切片(×40)

圖5 熒光顯微鏡下A組和B組肝臟內(nèi)綠色熒光細(xì)胞表達(dá)的典型冰凍切片(×40)

圖6 熒光顯微鏡下A組和B組心臟移植物內(nèi)綠色熒光細(xì)胞表達(dá)的典型冰凍切片(×40)

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過移植心臟升主動(dòng)脈途徑注射BMSCs后，細(xì)胞主要分布于移植心臟內(nèi)。BMSCs經(jīng)過動(dòng)脈注射后，細(xì)胞進(jìn)入移植心臟的毛細(xì)血管網(wǎng)，器官移植術(shù)后早期有缺血再灌注損傷，能產(chǎn)生趨化因子，加上血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，細(xì)胞間隙增加，同時(shí)分泌黏附分子增加，利于BMSCs進(jìn)入組織內(nèi)定植[7-8]。少部分BMSCs經(jīng)過血液回流進(jìn)入肺內(nèi)，滯留于肺的毛細(xì)血管網(wǎng)，但是肺內(nèi)的BMSC數(shù)量明顯少于移植心臟。經(jīng)過移植心臟右心室腔內(nèi)注射BMSCs后，細(xì)胞主要分布于肺內(nèi)，肺內(nèi)的BMSCs數(shù)量大大超過移植心臟內(nèi)的BMSCs數(shù)量，這是由于細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)后體積較大，大部分細(xì)胞滯留于肺的毛細(xì)血管網(wǎng)[9-10]，少部分細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)，由于移植的心臟存在缺血再灌注損傷，能分泌趨化因子，血液循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的BMSCs趨化到移植的心臟并定植[11]。

本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)移植心臟內(nèi)的BMSCs存活時(shí)間有限，動(dòng)脈途徑移植細(xì)胞存活時(shí)間不超過2周，移植心臟右心室腔內(nèi)注射途徑細(xì)胞存活時(shí)間約7 d，其原因是移植心臟內(nèi)微環(huán)境較為惡劣，不利于BMSCs在心臟內(nèi)長(zhǎng)期存活，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[12]。動(dòng)脈途徑移植細(xì)胞存活時(shí)間長(zhǎng)的原因可能為動(dòng)脈途徑注射BMSCs后定植的細(xì)胞相對(duì)較多。對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理如基因修飾[13]、低氧預(yù)處理[14-15]等方法，能改善干細(xì)胞的存活，有利于干細(xì)胞最大限度地發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。在臨床器官移植領(lǐng)域，應(yīng)用該細(xì)胞來調(diào)節(jié)免疫排斥反應(yīng)，應(yīng)該考慮細(xì)胞的存活時(shí)間，可以對(duì)BMSCs進(jìn)行預(yù)處理，必要時(shí)可反復(fù)多次注射干細(xì)胞。

本研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈途徑較靜脈途徑注射BMSCs，更多的細(xì)胞聚集在移植心臟內(nèi)，存活時(shí)間更久，因此動(dòng)脈途徑注射的方法更有利于BMSCs充分發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。但是動(dòng)脈移植BMSCs需要應(yīng)用介入的方法，有一定的創(chuàng)傷，而且動(dòng)脈注射有栓子栓塞的風(fēng)險(xiǎn)。Cui以及Guzman等[16-17]報(bào)道頸內(nèi)動(dòng)脈內(nèi)注射干細(xì)胞后能引起中風(fēng)，增加了動(dòng)物的病死率，其原因是栓子栓塞。我們分析可能是與移植細(xì)胞的濃度、注射的速度有關(guān)。我們的方法使用的細(xì)胞濃度是1×106/30 μL，移植前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)洗滌并過濾掉壞死的細(xì)胞，細(xì)胞移植時(shí)控制速度盡可能慢，經(jīng)動(dòng)脈途徑移植BMSCs后，心臟病理學(xué)改變未見微循環(huán)栓塞的改變，說明只要注意細(xì)胞的濃度和注射速度，優(yōu)化細(xì)胞的準(zhǔn)備過程，完全可以避免栓塞并發(fā)癥。

經(jīng)動(dòng)脈注射途徑和靜脈注射途徑移植BMSCs后，僅術(shù)后第3天，肝臟內(nèi)可見綠色熒光細(xì)胞，這是由于循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的BMSCs經(jīng)過肝臟微循環(huán)時(shí)被動(dòng)滯留于肝臟組織，但是由于缺乏趨化因子的作用，我們分析這些細(xì)胞只是經(jīng)過肝臟的微循環(huán)時(shí)被動(dòng)的滯留在肝臟組織內(nèi)，未能在肝臟內(nèi)定植[18]。

本研究并未涉及到BMSCs在其他組織中的分布，如受體心臟、脾臟、腎臟、胸腺、淋巴結(jié)等等，我們認(rèn)為由于缺乏趨化因子，干細(xì)胞趨化到這些組織中的可能性較小[19]，即便細(xì)胞能夠在這些組織毛細(xì)血管網(wǎng)滯留，由于細(xì)胞數(shù)量少、存活時(shí)間短，發(fā)揮的治療作用有限。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，移植器官動(dòng)脈注射較靜脈注射BMSCs，能使更多的細(xì)胞聚集于移植器官內(nèi)，存活時(shí)間更久，可能更有利于BMSCs在移植物局部發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，而靜脈途徑注射干細(xì)胞后細(xì)胞大量的聚集在肺內(nèi)，趨化到移植器官內(nèi)的干細(xì)胞較少。在臨床上應(yīng)用BMSCs調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，應(yīng)該考慮細(xì)胞注射途徑對(duì)細(xì)胞在體內(nèi)分布的影響。