循環(huán)腫瘤細胞在結(jié)直腸癌臨床診療中的應(yīng)用

謝禮鋒， 陳鴻源， 許 超(綜述)， 薛芳沁(審校)

結(jié)直腸癌高發(fā)于發(fā)達國家和地區(qū)，但隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展和城市化的進程加快，居民飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣的改變，近年來，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢[1]。結(jié)直腸癌是造成全球疾病負擔(dān)的第三大腫瘤，發(fā)病率僅次于肺癌和乳腺癌，嚴(yán)重威脅居民健康[2]。隨著結(jié)直腸癌的診斷方法、手術(shù)技巧及治療方案的不斷優(yōu)化，患者的預(yù)后得到一定程度的改善。手術(shù)切除是結(jié)直腸癌的主要治療手段，但復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致預(yù)后不良的重要因素[3]。研究表明，腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移與血液中存在的循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell, CTC)形成的微轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4]。1869年，Ashworth教授首先提出了CTC的概念，CTC是指自發(fā)或因診療操作由實體腫瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放進入外周血循環(huán)的游離腫瘤細胞，進入循環(huán)后未被清除的腫瘤細胞通過遷移、黏附、相互聚集形成微小癌栓，最終發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶[5]。CTC具有與原發(fā)腫瘤病灶高度相同的腫瘤特異性抗原和基因?qū)W特征，具有極高的腫瘤特異性，可用于惡性腫瘤疾病的體外“液體活檢”[6]。目前，依賴影像學(xué)和腫瘤標(biāo)志物的檢查，難以發(fā)現(xiàn)早期腫瘤的生長，而檢測外周血中的CTC快捷無創(chuàng)，對于早期發(fā)現(xiàn)腫瘤、動態(tài)監(jiān)測療效和評估預(yù)后等都具有極高的臨床應(yīng)用價值。

1 CTC的富集和分析

1.1CTC的富集與分離 CTC在腫瘤患者的外周血中數(shù)量極少，每10 mL的血液中僅有幾個至十幾個[7]，需要先將外周血中的CTC進行分離和濃縮，以提高檢測的靈敏度。目前，CTC的富集和分離主要是根據(jù)物理學(xué)和免疫學(xué)特征將其從外周血細胞中篩選出來?；贑TC的物理特性，例如細胞大小、密度和電學(xué)特性；基于抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫富集方法，包括正向富集和負向富集兩種。

1.1.1基于CTC的物理學(xué)特性 研究表明，腫瘤細胞的直徑為15～25 μm，而白細胞直徑為8～14 μm，根據(jù)細胞直徑的不同，利用具有一定大小的濾過膜可以將直徑較大的CTC富集分離出來[8]。基于外周血的各種細胞密度差異產(chǎn)生不同的細胞沉降系數(shù)，紅細胞、白細胞和腫瘤細胞的相對密度分別為1.092，1.065和1.056[9]。利用密度梯度離心法，將外周血中不同密度的細胞組分進行分離。Rosenberg等運用此法對CTC進行富集，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者外周血的CTC陽性率為41%[10]。該方法對設(shè)備的要求不高，操作較為簡單，但易導(dǎo)致缺乏相應(yīng)密度的腫瘤細胞丟失。不同細胞具有不同的電學(xué)特性，在電場中，這些細胞產(chǎn)生的電偶極距大小和方向存在差異，利用其受到的力學(xué)作用不同，將目的細胞分離出來。利用電學(xué)原理在血液中捕獲腫瘤細胞的效率可達70%[11]?；诩毎锢韺W(xué)特性富集的CTC細胞形態(tài)保存完整，細胞表面的各種抗原或分子均未被破壞，簡單且易于操作，但靈敏度較低。

1.1.2基于CTC的免疫學(xué)特性 外周血腫瘤細胞免疫富集的方法是基于抗原抗體特異性結(jié)合的原理，分為正向富集和負向富集兩類。正向富集是針對CTC表面表達的特異性腫瘤細胞抗原，如EpCAM，利用帶有標(biāo)記的外源性EpCAM抗體與之結(jié)合，從而達到CTC的直接捕獲和富集。近年比較常用的Cell Search系統(tǒng)就是基于免疫磁珠法進行正向富集，也是目前唯一一個獲得FDA批準(zhǔn)上市的產(chǎn)品。此外，還有磁珠分選系統(tǒng)MACS(Miltenyi Biotec Gmb H)和Mag Sweeper系統(tǒng)[12-13]，其CTC的富集特異度大大提高。在提高檢出特異度的同時，為了避免檢出敏感度的下降，Adna Test采用了含多種抗體的免疫磁珠對CTC進行分選。反之，負向富集的的靶點則是白細胞表面的抗原，例如CD45，利用外源性CD45抗體結(jié)合白細胞后，將白細胞篩除，從而達到去除背景血細胞而富集CTC的效果。Easy Sep?系統(tǒng)(Stem Cell)就是采用CD45免疫磁珠對外周血腫瘤細胞進行富集，其陽性率約64%[14]。負向富集的方法不依賴CTC表面特異性抗原，具有通用性，適用于各種腫瘤細胞樣本，但其富集純度較低。近年，基于微流體芯片的免疫吸附法也開始應(yīng)用于科研和臨床[15]，其原理類似于免疫磁珠法，微柱狀陣列結(jié)構(gòu)表面上包被的EpCAM抗體與流過的外周血中CTC相結(jié)合，達到截留富集目的。

1.2CTC的檢測與分析 CTC的檢測分析方法分兩大類：細胞計數(shù)法和核酸檢測法。前者主要包括免疫細胞化學(xué)法和流式細胞術(shù)等，后者主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等。免疫細胞化學(xué)法以顯色劑標(biāo)記的特異性抗體進行細胞原位抗原抗體反應(yīng)和化學(xué)呈色反應(yīng)，對相應(yīng)腫瘤抗原可進行定性、定位和定量測定，但敏感性不高。流式細胞術(shù)是一項集激光、電子物理、光電測量、計算機、細胞熒光化學(xué)及單克隆抗體技術(shù)為一體的新型技術(shù)，定量計數(shù)腫瘤細胞，數(shù)據(jù)精確，還可對細胞進行多參數(shù)分析，但價格昂貴、耗時較長，限制了該技術(shù)在臨床中的廣泛應(yīng)用[16]。PCR技術(shù)檢測腫瘤患者外周血中的CTC是通過檢測血細胞中癌基因和抑癌基因的異常表達，該方法敏感性雖高，但假陽性率也較高，適用范圍有限。RT-PCR技術(shù)是在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來，擴增由血細胞中表達的腫瘤特異性mRNA序列逆轉(zhuǎn)錄的DNA片段，從而分析腫瘤特異性mRNA的表達水平。這些腫瘤特異性mRNA不表達于正常外周血細胞，且半衰期較短，在細胞裂解后會迅速被RNA酶降解，有較高的敏感性和特異性。在外周血中檢測到腫瘤特異性mRNA可以間接提示CTC的存在，腫瘤特異性mRNA水平可以間接反應(yīng)CTC水平[17]。RT-PCR及其各種改進的技術(shù)可以對腫瘤特異性mRNA進行相對定量，甚至絕對定量，目前在CTC的檢測中應(yīng)用最為廣泛，被認(rèn)為是目前檢測CTC最有效的方法之一。

2 影響血液CTC水平的因素

2.1腫瘤疾病本身 CTC從實體瘤中脫落入血，其在血液中的數(shù)量與原發(fā)灶的性質(zhì)、進展程度及機體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)。CTC在血液中的水平與腫瘤的臨床分期、分化程度、浸潤深度、脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)均密切相關(guān)。Sastre等使用Cell Search系統(tǒng)檢測了94例結(jié)直腸癌患者的外周血CTC，發(fā)現(xiàn)CTC的陽性率為36.2%，且與結(jié)直腸癌的臨床分期相關(guān)(Ⅱ期20.7%，Ⅲ期24.1%，Ⅳ期60.7%)[18]。在無遠處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者中，其CTC數(shù)量隨著腫瘤的T分級、N分級、腫瘤大小、分化程度的惡性度升高而上升[19]。Akiyoshi等認(rèn)為，CTC的數(shù)量也與腫瘤細胞的侵襲性顯著相關(guān)，經(jīng)病理證實，中低分化的腫瘤細胞較高分化者，外周血更易檢出CTC[20]。此外，CTC存在于外周血中，要克服血流的剪切力、免疫系統(tǒng)、細胞因子及低氧等各種血液微環(huán)境的影響，其數(shù)量隨著由瘤灶脫落后的時間延長而減少[21]。反之，從外周血中檢測CTC的水平亦可反映腫瘤病灶的惡性程度、治療效果以及腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。傳統(tǒng)評估腫瘤的惡性度，需先進行手術(shù)切除腫瘤病灶，且進行病理檢測，并根據(jù)病理結(jié)果進行臨床分期、選擇化療方案和評估預(yù)后，具有一定的盲目性。在臨床診療過程中，術(shù)前主要通過影像學(xué)檢測評估腫瘤是否發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，而部分患者發(fā)生遠處微轉(zhuǎn)移是影像學(xué)檢測不到的，這時通過檢測CTC進行評估可能是一個不錯的選擇。

2.2取樣部位 結(jié)直腸癌患者CTC的檢出率和表達水平與血樣采集血管的部位相關(guān)，腫瘤灶引流靜脈血和外周靜脈血往往存在一定差異。腫瘤病灶脫落入血的游離腫瘤細胞首先進入引流靜脈(腸系膜靜脈)，再經(jīng)過門脈系統(tǒng)進入肝臟，最后匯入外周循環(huán)。因肝臟的過濾作用造成外周血中CTC水平比引流靜脈低。Rahbari等利用Cell Search系統(tǒng)檢測了200例結(jié)直腸癌患者腸系膜靜脈和外周靜脈中的CTC水平，發(fā)現(xiàn)Ⅱ及Ⅲ期結(jié)腸癌和中上段直腸癌的腸系膜靜脈血CTC的檢出率較外周靜脈更高[22]。門靜脈或腸系膜靜脈血中CTC水平較外周靜脈血高，預(yù)示著發(fā)生肝轉(zhuǎn)移風(fēng)險性明顯增高[23]。腫瘤細胞由引流靜脈播散至遠處臟器，早期腫瘤患者外周靜脈血液中腫瘤細胞數(shù)量極少，臨床和科研中常從引流靜脈取血進行CTC檢測。

2.3手術(shù)操作 手術(shù)操作過程中，腫瘤組織受到擠壓、牽拉，易導(dǎo)致腫瘤細胞脫落入血，造成腫瘤播散的風(fēng)險。Lelievre等通過動物實驗對比了腹腔鏡與開腹兩種術(shù)式對CTC的影響，發(fā)現(xiàn)術(shù)前及術(shù)后CTC的檢測率并未上升，且各手術(shù)組間并無差別，首次通過CTC對不同手術(shù)方式的腫瘤學(xué)效應(yīng)進行了比較[24]。Park等通過對42例結(jié)腸癌患者的手術(shù)進程中的不同時間點，腸系膜下靜脈和外周血CEA mRNA和CK20 mRNA的水平進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)其在術(shù)前外周靜脈血和腸系膜下靜脈血中的陽性率無顯著差別；調(diào)整腫瘤腸段后，其檢出率有升高趨勢，手術(shù)后較術(shù)前檢出率顯著升高，但不同手術(shù)方式間并無顯著性差異；認(rèn)為無瘤操作技術(shù)是影響CTC入血數(shù)量的主要因素，而非手術(shù)方式[25]。Jussf等研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)中采血是提高CTC捕獲效率的一個有效途徑[26]。手術(shù)使用的器械對腫瘤細胞入血也有一定影響，如超聲刀可使切開的組織及時凝固、血管閉合，降低癌細胞播散的機會[27]。“無瘤原則”是腫瘤根治術(shù)的基本原則，術(shù)中嚴(yán)格遵守?zé)o瘤原則，對減少腫瘤醫(yī)源性擴散及術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、提高遠期療效有重要意義。

2.4檢測技術(shù)和方法 結(jié)直腸癌患者的CTC檢出率及表達水平與游離腫瘤細胞的富集和檢測技術(shù)密切相關(guān)。有效的檢測方法要求外周血富集后，能有效地區(qū)分外周血細胞和腫瘤細胞。至今為止，已開發(fā)超過40種檢測技術(shù)，且不斷有新的方法和技術(shù)出現(xiàn)，其敏感度和特異度各異[28-29]。Cell Search系統(tǒng)是基于免疫學(xué)原理最具代表性的CTC檢測技術(shù)，在上皮表型陰性的樣本中存在不同比例的CTC漏檢，例如EMT標(biāo)志物在CK陰性和陽性的CTC中的陽性率分別為38%和28%，意味著如果僅用上皮性抗原作為CTC富集的標(biāo)志，將會有三分之一以上的CTC被漏檢[30]?；贑TC的物理特性，不依賴細胞表面標(biāo)志的檢測技術(shù)較好地克服了上述缺陷，如微流控芯片技術(shù)和微過濾技術(shù)[31]。Farace等用基于上皮腫瘤細胞體積的分離技術(shù)(ISET)檢測腫瘤患者外周血CTC，結(jié)果陽性率為95%[32]，而Cell Search系統(tǒng)的檢測陽性率僅為70%。Li等應(yīng)用Cell search系統(tǒng)和ISET技術(shù)對61例食管鱗狀細胞癌患者進行檢測和對比，發(fā)現(xiàn)ISET方法檢出CTC 20例(32.8%)，而Cell Search系統(tǒng)檢出1例(1.6%)，兩者差別較大[33]。為了避免僅用單一方法檢測CTC出現(xiàn)的種種弊端，近年來應(yīng)用多種方法聯(lián)合檢測也屢見不鮮。

3 CTC檢測的臨床應(yīng)用

外周血CTC水平可以反映腫瘤患者循環(huán)中游離腫瘤細胞的負荷，其水平的變化可作為治療反應(yīng)的一個敏感指標(biāo)。惡性腫瘤疾病患者遠處器官微轉(zhuǎn)移與外周血中存在的CTC密切相關(guān)。CTC具有與腫瘤病灶高度相似的腫瘤特異性抗原或基因特征，從外周血中即可獲得，對CTC基因進行檢測可以間接反映腫瘤原發(fā)灶的生物學(xué)特征。CTC在腫瘤疾病的臨床診斷、治療指導(dǎo)及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移監(jiān)測中具有重要的臨床應(yīng)用前景。

3.1CTC與腫瘤疾病診斷 CTC具有與原發(fā)腫瘤病灶高度相同的腫瘤特異性抗原和基因?qū)W特征，具有極高的腫瘤特異性。CTC“液態(tài)活檢”相對無創(chuàng)，對結(jié)直腸癌的診斷具有一定臨床價值。Wensy等報道，在620例門診患者中，腸鏡下診斷為腺瘤性息肉或早期至晚期結(jié)直腸癌438例，進一步行CTC檢測發(fā)現(xiàn)，111例(25%)為癌前病變，327例(75%)為結(jié)直腸癌，即CTC檢出癌前病變的靈敏度為76.6%、特異度為97.3%；檢出結(jié)直腸癌的靈敏度為86.9%、特異度為97.3%；檢出癌前病變和結(jié)直腸癌的準(zhǔn)確率達88.0%[34]。提示CTC檢測有利于早期發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌。另有研究表明，在非轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者中，檢測到的CTC平均數(shù)量隨著腫瘤的T分期、N分期、腫瘤大小及分化程度的惡性度的升高而增加，而與患者的性別、年齡、CEA水平及大體類型無關(guān)[35]。CTC在早期腫瘤患者外周血中的數(shù)量極少，需經(jīng)有效的方法富集和分離后才可檢出，在早期腫瘤的臨床診斷應(yīng)用上具有一定局限性。

3.2CTC用于指導(dǎo)治療 結(jié)直腸癌術(shù)后輔助化療或者姑息化療的目的是清除殘留在循環(huán)中的游離腫瘤細胞以及微轉(zhuǎn)移灶，其基因?qū)W特性與手術(shù)切除的原發(fā)灶高度相似，但亦可能存在細微變異。直接檢測循環(huán)中CTC細胞的基因?qū)W特性或表觀遺傳學(xué)特征，可更直接指導(dǎo)輔助化療用藥。Musella等研究提示，通過CTC的基因檢測，可在接受治療前預(yù)測出抗表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)治療的療效，從而決定是否進行抗EGFR治療[36]。結(jié)直腸癌治療過程的一個重要挑戰(zhàn)就是如何選擇安全、可靠、及時的療效評估手段以驗證治療方法的有效性，或?qū)πЧ患训闹委煼桨高M行調(diào)整，對CTC的監(jiān)測在這方面具有重要的應(yīng)用價值。Zhang等發(fā)現(xiàn)，CTC的持續(xù)陽性是接受化療的晚期結(jié)直腸癌患者無進展生存期和總體生存率的獨立危險因素[37]。對進展期和轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，化療和靶向治療的主要挑戰(zhàn)是腫瘤基因組的不穩(wěn)定性和治療誘導(dǎo)性耐藥，故需開展連續(xù)動態(tài)活組織檢查，才能精準(zhǔn)指導(dǎo)制訂治療決策[38]。在耐藥性方面，Abdallah等研究表明，通過CTC的胸苷酸合成酶的檢測，可預(yù)測出對5-氟尿嘧啶抵抗的患者[39]。轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者檢測CTC更有意義，CTC的分子特征，尤其在細胞粘附、EMT方面比原發(fā)灶腫瘤細胞更能提示遠處轉(zhuǎn)移的跡象[40]。

3.3CTC用于復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的監(jiān)測 結(jié)直腸癌患者根治術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移歸因于腫瘤細胞的傳播，此風(fēng)險目前不能完全通過TNM分期系統(tǒng)進行評估。復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者根治術(shù)后的主要死亡原因。Lu等證實，CTC持續(xù)陽性是Ⅱ～Ⅲ期結(jié)直腸癌患者復(fù)發(fā)及預(yù)后不良的危險信號[41]。Bork的研究也證實，CTC陽性是結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨立預(yù)后危險因素[42]。然而，到底是術(shù)前還是術(shù)后的CTC數(shù)量提供更可靠的預(yù)后信息，目前并不明確。Aggarwal等發(fā)現(xiàn)，治療前CTC水平較低的患者(<3個，n=99)比較高的患者(≥3個，n=58)有更長的生存時間(20.8月vs11.7月)，且所有患者治療前血液中CEA均為陽性，可見CTC可提供更多預(yù)后信息[43]。當(dāng)前，迫切需要尋找一個理想的能早期準(zhǔn)確地評估胃腸腫瘤患者發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的指標(biāo)，以使結(jié)直腸腫瘤的診療更加規(guī)范。

此外，CTC的體內(nèi)或體外研究有助于開發(fā)新型抗癌藥物，研究藥物抵抗的作用機制，指導(dǎo)臨床用藥[44]。從分子學(xué)水平無創(chuàng)地對結(jié)直腸癌病情進行分析和診治，避免了傳統(tǒng)診治方法的弊端(需先手術(shù)切除病變組織進行病理檢測后再決定下一步診治方案)，能實現(xiàn)體外腫瘤基因分析，精準(zhǔn)選擇治療方案，是人類未來腫瘤疾病治療的總體趨勢。

4 展 望

大量研究證實，CTC與腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，檢測CTC有助于腫瘤轉(zhuǎn)移的早期診斷、臨床分期、療效監(jiān)測及預(yù)后判斷，并為腫瘤患者的個體化治療提供有價值的臨床指導(dǎo)。CTC作為結(jié)直腸癌獨立的預(yù)后因素，可反映循環(huán)腫瘤負荷及腫瘤的生物學(xué)特性。有關(guān)結(jié)直腸癌CTC的研究還在不斷地深入，但問題依然存在[45]：(1)缺乏理想的CTC分子標(biāo)志和陽性計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)；(2)如何分析其異質(zhì)性；(3)CTC在循環(huán)中存活及其基因型和表觀遺傳特性發(fā)揮作用的機制；(4)CTC體外培養(yǎng)技術(shù)難度高，傳代后基因型和表觀遺傳學(xué)。隨著高通量測序以及單細胞基因組擴增技術(shù)的優(yōu)化，CTC的未來朝著單細胞組學(xué)發(fā)展，擺脫了腫瘤組織標(biāo)本的限制，使非創(chuàng)傷性診斷、監(jiān)測成為了可能，為結(jié)直腸癌的診斷、治療監(jiān)測、預(yù)后評估等提供了簡便途徑。這也將有助于臨床醫(yī)師更深入地了解腫瘤轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性，動態(tài)實時地分析患者的腫瘤分子特征，為真正的個體化治療提供有價值的依據(jù)。