白芨水煎劑對(duì)結(jié)腸黑變病模型豚鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白的影響

張兆林 陳凍伢 徐 虹 徐建軍 馮 慧 陳建永

結(jié)腸黑變?。∕elanosis coli，MC）指結(jié)腸黏膜固有層內(nèi)巨噬細(xì)胞含脂褐素（Lipofuscin）或黑色素（Melanin）的一種黏膜色素沉著性病變。MC多見于長期便秘以及服用蒽醌類（Anthraquinone）藥物的患者[1]。大劑量連續(xù)服用1～4個(gè)月，即可見一定程度MC的發(fā)生。MC患者結(jié)腸黏膜出現(xiàn)增生性病變的機(jī)會(huì)大大增加，其中結(jié)腸癌和結(jié)腸腺瘤性息肉的發(fā)生率高，少數(shù)患者還可出現(xiàn)假性腸狹窄[2]。目前普遍認(rèn)為MC與結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡存在一定的相關(guān)性。腫瘤細(xì)胞壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF-α）能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）和Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）在細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵作用，是一對(duì)具有拮抗作用的基因。藥理研究證實(shí)，白芨水煎劑灌服能保護(hù)大鼠胃黏膜，抑制潰瘍發(fā)生；還能促進(jìn)表皮損傷的愈合，促進(jìn)基底膜修復(fù)[3]。本研究通過大黃提取液灌胃制備MC模型豚鼠，并予10%白芨水煎劑灌腸，通過檢測腸黏膜上皮細(xì)胞的凋亡以及TNFα、Bcl-2和Bax表達(dá)，探討白芨水煎劑對(duì)蒽醌類藥物所致MC的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物 健康豚鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量（400g±20）g，清潔級(jí)，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)：SYXK（浙）2013-0184。采用架式籠養(yǎng)喂養(yǎng)，每籠4只，雌雄分籠喂養(yǎng)。普通飼料，自由飲水，室溫保持在20℃左右，相對(duì)濕度40～60%，光照周期12h。

1.2 藥 物 實(shí)驗(yàn)藥物大黃、白芨均購自浙江省醫(yī)藥公司，生產(chǎn)單位杭州桐君堂中藥飲片廠，批號(hào)20150713。大黃提取工藝：大黃飲片機(jī)械粉碎成70mm粗粉，8倍量70%乙醇回流提取3次，每次1.5h。提取液合并過濾，60℃減壓濃縮，制成大黃提取液（每1mL相當(dāng)于生藥3g），置4℃冰箱保存。10%白芨水煎劑制備工藝：白芨干燥，粉碎，水提取前冷浸30min，加入10倍蒸餾水煎煮2次，共煎煮2h。無菌4層紗布過濾雜質(zhì)，合并濾液濃縮，制成白芨水煎劑（每1mL相當(dāng)于生藥0.1g），置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑 原位細(xì)胞凋亡熒光檢測試劑盒購自德國Roche公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，購自碧云天生物技術(shù)公司；抗TNFα小鼠單克隆抗體購自美國Abcam公司；抗Bcl-2兔多克隆抗體、抗Bax兔多克隆抗體、抗GAPDh小鼠單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司。

1.4 MC豚鼠模型制備 將40只豚鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為三組，正常組8只，模型組16只，白芨水煎劑組16只。模型組及白芨組均予大黃提取液6g·kg-1·d-1連續(xù)灌胃60天，造模第3周模型組開始予生理鹽水灌腸，白芨組予10%白芨水煎劑灌腸，每周3次，灌腸方法如下，將8F導(dǎo)尿管涂抹凡士林后從肛門輕輕插入5cm，推入2mL藥液并捏緊肛門倒放5min。造模結(jié)束后，各組豚鼠予25%烏拉坦按0.7mL/100g腹腔麻醉處死。處死前豚鼠均禁食、禁水24h。處死后立刻剖取盲腸及全部結(jié)腸，取適量結(jié)腸標(biāo)本，用4℃生理鹽水反復(fù)清洗腸腔內(nèi)容物，置于10%中性甲醛液及液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 結(jié)腸組織蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色和黑色素染色 取10%中性甲醛液固定組織，石蠟包埋切片，切片厚度3～5μm，常規(guī)HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察。取石蠟包埋的組織，切片厚度3～5μm，脫蠟洗滌后投入M.F.溶液中，置于暗室12h，投入5%硫代硫酸鈉2min，用中性紅復(fù)染后脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6 脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記（Terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL）染色 操作步驟根據(jù)Roche公司的In Situ Cell Death Detection Kit Fluorescein說明書進(jìn)行：烤片2～3h脫蠟后二甲苯浸洗，依次用梯度乙醇浸洗，0.01M PBS沖洗后抗原修復(fù)，滴加封閉用正常山羊血清室溫孵育30min，滴加50μL TUNEL反應(yīng)液37℃避光孵育60min，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)光波長450～500nm，檢測波長515-565nm（綠色），計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞。

1.7 免疫印跡 取各組離體的豚鼠結(jié)腸加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。每組取50μg樣品蛋白，進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳。將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，以含5%脫脂奶粉的TTBS 液 （0.121%Tris，0.9%NaCl，0.1%Tween-20，ph7.5）室溫封閉1h。加入抗TNFα小鼠單克隆抗體（1:1000），抗 Bcl-2兔多克隆抗體（1:500）或抗 Bax兔多克隆抗體（1:500）4℃孵育過夜，TTBS洗膜3次，除去未結(jié)合的一抗，然后相應(yīng)加入hRP藕聯(lián)兔抗小鼠IgG或hRP藕聯(lián)山羊抗兔IgG，室溫孵育1h。TTBS洗膜3次后進(jìn)行ECL顯影曝光。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。數(shù)據(jù)資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s） 表示。多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，用LSD Post hoc Tests檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸黏膜黑變病評(píng)分 肉眼觀察正常組豚鼠結(jié)腸呈淺紅色，未見明顯色素沉著。模型組及白芨組豚鼠結(jié)腸則有不同程度的黑變出現(xiàn)。以盲腸與近端結(jié)腸最為顯著，其余小腸等組織未見黑變。病變結(jié)腸黏膜尚光滑，反光較差，彈性降低，表面呈淺褐色或深褐色，與正常腸黏膜分界不清。白芨組豚鼠結(jié)腸黏膜顏色較模型組淺，黑變組織面積少（見插頁圖1）。

圖1 各組豚鼠結(jié)腸黏膜

圖2 結(jié)腸組織hE和黑色素染色（×200） （A）hE染色；（B）黑色素染色

圖3 豚鼠結(jié)腸組織TNFα蛋白表達(dá)

圖4 豚鼠結(jié)腸組織Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)

用10%中性甲醛液固定的組織標(biāo)本黏膜層朝上，平鋪在白色硬紙板上，大頭針固定，用放大鏡觀察腸黏膜標(biāo)本的黑變程度并評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[4]：無黑變0分，盲腸1分，盲腸和部分近段結(jié)腸2分，全結(jié)腸3分；顏色：淺紅色0分，淺褐色1分，暗褐色2分，深褐色3分。模型組結(jié)腸黏膜與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），白芨組結(jié)腸黏膜與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組豚鼠結(jié)腸黏膜黑變病評(píng)分（分，x±s）

2.2 hE染色和黑色素染色 HE染色結(jié)果顯示，正常組豚鼠的結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，腺體及隱窩清晰可見，黏膜固有層及黏膜下層未見炎細(xì)胞浸潤，固有層內(nèi)未見含有棕褐色顆粒的巨噬細(xì)胞。模型組則見結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞大量脫落，固有層及黏膜下層可見明顯中性粒細(xì)胞浸潤，隱窩及腺體減少，結(jié)構(gòu)紊亂，黏膜肌層與固有層間見較多棕褐色色素顆粒沉著。白芨組結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞少量脫落，固有層及黏膜下層可見少量中性粒細(xì)胞侵潤，固有層散在分布棕黃褐色色素顆粒（插頁圖2A）。黑色素染色如插頁圖2B所示，模型組及白芨組豚鼠的結(jié)腸黏膜呈現(xiàn)不同程度的陽染色素顆粒，且白芨組陽性程度較模型組輕微，正常組未見黑色素陽染區(qū)域。

2.3 各組豚鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡檢測 采用TUNEL（FITC熒光法）對(duì)腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測，并使用Image-pro PLUS 5.1版圖像分析軟件，每個(gè)樣本隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)1，000個(gè)細(xì)胞采用灰度值120～145，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比，對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡的表達(dá)率進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示，與正常組相比較，模型組豚鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡陽性率顯著增高（P＜0.01），白芨組豚鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡陽性率比模型組顯著下降（P＜0.01），見表 2。

表2 各組TUNNEL染色陽性率比較（%，x±s）

2.4 各組豚鼠結(jié)腸組織TNFα表達(dá) 與正常組比較，模型組豚鼠結(jié)腸組織TNFα蛋白表達(dá)量顯著增高，為正常組的 4.27倍（P＜0.01）。白芨組豚鼠結(jié)腸TNFα表達(dá)量較模型組顯著下降，為模型組的54.6%（P＜0.01），見表 3，插頁圖 3。

表3 各組豚鼠結(jié)腸組織TNFα表達(dá)水平比較（x±s）

2.5 各組豚鼠結(jié)腸組織Bcl-2和Bax表達(dá) 與正常組比較，模型組豚鼠結(jié)腸組織Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著增加，為正常組的3.68倍（P＜0.01）。白芨組的Bcl-2表達(dá)為模型組的 47.8%（P＜0.01）。相反，模型組豚鼠結(jié)腸組織Bax的表達(dá)量與正常組相比顯著下降，為正常組的45.0%（P＜0.01）。白芨組Bax表達(dá)比模型組顯著增高，為模型組的 1.96 倍（P＜0.01）。見表 4，插頁圖4。

3 討論

目前普遍認(rèn)為蒽醌類瀉藥如美鼠李皮、番瀉葉、大黃等為主的蒽醌類瀉藥長期服用為MC發(fā)生的主要因素[5]。劉中輝等[6]在回顧性研究350例完成結(jié)腸鏡檢查的患者中，結(jié)腸黑變病組結(jié)腸息肉發(fā)現(xiàn)率達(dá)40.8%，遠(yuǎn)高于非結(jié)腸黑變病的23.0%，認(rèn)為MC患者結(jié)腸息肉發(fā)生率高。此外，有研究發(fā)現(xiàn)MC與結(jié)腸癌存在一定的關(guān)系[7]。

表4 各組豚鼠結(jié)腸組織Bcl-2和Bax表達(dá)水平比較（x±s）

Byers等[8]指出，結(jié)腸上皮凋亡數(shù)目與MC嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。Chiu等[9]研究認(rèn)為，大黃素等游離蒽醌可通過Bax與Fas信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。Britta等[10]發(fā)現(xiàn)，長期服用瀉藥患者的結(jié)腸黏膜Bcl-2表達(dá)增加。長期服用蒽醌類瀉藥可使腸黏膜上皮細(xì)胞損傷、凋亡，產(chǎn)生的凋亡小體透過基底膜小孔轉(zhuǎn)移至黏膜固有層。此類物質(zhì)在巨噬細(xì)胞中形成次級(jí)溶酶體的過程中，因溶酶體過載，導(dǎo)致細(xì)胞分解代謝障礙，最終持續(xù)形成大量脂褐素或黑色素。隨著長期應(yīng)用蒽醌類瀉藥，最終形成典型的MC[11]。TNFα可以增加白細(xì)胞以及血管壁的黏附性，以致微血管遲發(fā)性低灌注，對(duì)毛細(xì)血管有直接的毒性作用，且能誘導(dǎo)敏感細(xì)胞發(fā)生壞死和凋亡[12]。在細(xì)胞的凋亡調(diào)控過程中，各種基因之間存在著相互作用，其中Bcl-2和Bax被認(rèn)為在其中起著關(guān)鍵作用。在正常結(jié)腸組織Bcl-2表達(dá)較弱，而從腺瘤到腺癌進(jìn)展過程中，Bcl-2表達(dá)明顯增強(qiáng)[13]。Bax存在于Bcl-2家族中，是促進(jìn)凋亡的相關(guān)蛋白。Bcl-2/Bax比值決定細(xì)胞凋亡的發(fā)生與否，對(duì)凋亡的發(fā)生過程起著重要的調(diào)控作用[14]。

曾頌[3]研究指出，白芨水煎劑灌服能夠保護(hù)大鼠胃黏膜，抑制潰瘍發(fā)生，這可能與刺激胃黏膜合成與釋放內(nèi)源性前列腺素（Prostaglandin，PG）有關(guān)。白芨還可以促進(jìn)表皮損傷的愈合，加快基底膜修復(fù)。電鏡下對(duì)二甲氨基偶氮苯（Dimethylaminoazobellzane，DAB）誘導(dǎo)的大鼠肝癌細(xì)胞核增大，核膜彎曲凹陷，而予白芨注射液的肝細(xì)胞形態(tài)與正常肝細(xì)胞形態(tài)相近[15]。

本研究結(jié)果表明，白芨水煎劑可能通過抑制MC豚鼠結(jié)腸組織TNFα和Bcl-2蛋白表達(dá)，增加Bax表達(dá)，降低Bcl-2/Bax比值，抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡，從而改善MC。