激光針刀對椎動脈型頸椎病模型兔椎動脈磷脂酰肌醇3-激酶mRNA表達的影響

劉 芳 魏 威 劉承浩 汪存信 葉麗紅 劉 敏

椎動脈型頸椎?。–ervical spondylotic arteriopathy，CSA）是頸神經(jīng)根、脊髓、椎動脈和頸部交感神經(jīng)等受到刺激和壓迫而出現(xiàn)的一系列綜合癥候群，屬中醫(yī)“眩暈”、“中風先兆”等范疇[1-2]。研究表明，CSA 的發(fā)生與椎動脈血管狹窄、閉塞、迂曲形態(tài)密切相關[3]。針灸是CSA的傳統(tǒng)治療方法，已廣泛運用于臨床，但存在治療次數(shù)多，療效不持久易復發(fā)等缺點[4-5]。項目組前期采用激光針刀治療椎動脈型頸椎病取得了一定臨床療效，經(jīng)三維建模和有限元分析表明激光針刀能明顯改善血管狹窄程度，從而有效改善局域血液循環(huán)[6]。但目前關于激光針刀治療椎動脈型頸椎病的治療機制尚不明確。PI-3K（phosphatidylinositol 3-kinase）是胞內(nèi)具有催化活性的信號蛋白，其激活的結果是在質(zhì)膜上產(chǎn)生第二信使PIP3，PIP3與細胞內(nèi)含有PH結構域的信號蛋白AKT（Protein kinase B，蛋白激酶B）和PDK1（Phosphoinositide dependent kinase-1，3-磷酸肌醇依賴蛋白激酶1）結合，促使PDK1磷酸化AKT蛋白的Ser308導致AKT活化，形成PI-3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路。近年研究發(fā)現(xiàn)，電針可增加基質(zhì)細胞衍生因子SDF-1的表達[7]，電信號通過激活PI3K/AKT信號通路實現(xiàn)控制損傷組織血管再生進程[7-8]。血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管內(nèi)皮細胞特異性的肝素結合生長因子，為目前已鑒定出來的30多種與血管生成相關的因子中最重要的因子[9]。激光針刀是對傳統(tǒng)小針刀的改進。因此，為進一步揭示激光針刀治療椎動脈型頸椎病的治療機制，項目組通過動物實驗，對比激光針刀與針刺治療CSA的療效，探討可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 40只普通級健康成年新西蘭白兔，雌雄各半，體質(zhì)量（2.50±0.20）kg，由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供和飼養(yǎng)，動物合格證號：SYXK（浙）2013-0184。實驗動物均單籠飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，自然光線照射，室溫20～22℃，濕度40～60%。

1.2 主要試劑和儀器 He-Ne激光治療儀（上海嘉定光電儀器有限公司，JH30C型），針刀（北京卓越華友醫(yī)療器械有限公司，漢章針刀HZ系列），針灸針（江蘇省吳江市佳辰針灸器械有限公司，型號0.25mm×40mm）， 高純總RNA快速提取試劑盒購自 Generay公司（貨號：GK3016；批次 1703G01）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript-II Q RT SuperMix for qPCR購自 Vazyme公司（貨號：R222-01；批次 7E092G6）；qPCR試劑ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix購自 Vazyme公司（貨號：Q411-02；批次 7E092H6）；實驗引物由上海桑尼生物科技有限公司合成、純化。引物序列如下：OryActinForward：AGTGCGACGTGGACATCCG；OryActin Reverse：TGGCTCTAACAGTCCGCCTAG；目標基因 Gene ID：100009272；PCR 產(chǎn)物大小為：295bp。OryAKTForward：ATATTCCCGTCTTT CACCCACT；Ory AKTReverse：AACGCTGTCAACCAC TTTACTT；目標基因 Gene ID：100340228；PCR 產(chǎn)物大小為：321bp。OryPI3KForward：GGCTCAAAGACAA GAACAAAGG；OryPI3K Reverse：CCTTGTAACACAT CTCTTGAAACC；目標基因 Gene ID：100337822；PCR產(chǎn)物大小為：224bp。OryVEG FForward：CCCACGAA GTGGTGAAGT；OryVEGFReverse：CTCATCTCCCCTA TGTGC；目標基因 Gene ID：100008899；PCR 產(chǎn)物大小為：253bp。OD值測量儀器（高精度分光光度計）為Merinton SMA4000；定量 PCR儀為 CFX connect Real-Time PCR System，配套使用的分析軟件為BIO-RAD CFX Manager；相關耗材（Tip頭、EP管等）購自Kirgen公司，均為無RNase、DNase和無熱源的分子生物學耗材。

1.3 動物造模 采用胡曉梅等[10]介紹的誘發(fā)性直接復制方法進行造模。取同種屬異體家兔耳正中動脈血與25%生理鹽水混合（比例為1：1）共9mL分別注入模型家兔右側頸夾肌，橫突間肌與橫突棘肌的肌內(nèi)與肌間隙。注射前和注射2周后分別進行彩色超聲檢測，選取右側椎動脈血流速度減小＞10cm/s的兔作為成功模型。

1.4 分組與治療 將40只新西蘭白兔按隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、針刺組和激光針刀組，每組10只，除正常組外其它三組給予造模，2周后造模完成。正常組：不造模，僅在針刺組治療的同時對兔給予相同的固定操作。模型組：造模完成后，僅在針刺組治療的同時對兔給予相同的固定操作。針刺組：造模后第14天開始治療。取穴：風池穴、頸夾脊穴（C3-C7）。刺法：用30號1.5寸毫針于上述六個穴位直刺，施以捻轉(zhuǎn)補瀉手法，得氣后留針30min，其間隔10min行針1次。隔天治療1次，10次為1個療程，治療10次，治療20天床邊超聲檢測后處死家兔。激光針刀組：造模14天后開始治療。具體操作：（1）體位：用固定盒將家兔固定，取俯臥位、頸椎前屈，沿棘突及椎旁選定C5頸椎棘突旁夾脊穴（雙）作為治療點（遵照實驗動物穴位圖譜）；（2）皮膚消毒：常規(guī)碘伏皮膚消毒；（3）1%利多卡因局部麻醉；（4）激光針刀進行定點切割、剝離、松解、手感無結節(jié)、阻滯，留針He-Ne激光輻射，激光輸出功率200mW，擴束光斑模式，通斷方式輸出，總時間為30min，出針后創(chuàng)可貼外敷，24h內(nèi)保持創(chuàng)口干燥。治療每10天1次，3次為1個療程，治療20天彩色超聲檢測后處死家兔。

1.5 觀察指標及方法

1.5.1 激光針刀對家兔行為體征和體質(zhì)量的影響

從造模當天開始，每天觀察家兔的精神（眼瞼、運動情況）、皮毛光澤、鼻尾色、大便狀況及有無縮肩拱背以及覓食等情況，3天記錄1次。分別于造模前1天、造模后第14天（治療前）、造模后第24天（治療10天后）、造模后第34天（治療20天后）稱取記錄體質(zhì)量。

1.5.2 激光針刀對CSA兔PI-3K mRNA表達的影響 Trizol-離心柱法提取樣本總RNA。RNA純度的測定和RNA的定量，以相應溶劑為對照（Blank），取2μL RNA溶液于Merinton SMA4000檢測，觀察A260/A280、A260/A230比值及連續(xù)波長吸收峰，并計算RNA溶液濃度，判斷RNA提取質(zhì)量：A260/A280＞2.0且＜2.3，則可以滿足后續(xù)RT-qPCR所需。逆轉(zhuǎn)錄實驗。然后熒光定量PCR擴增實驗。qPCR實驗參數(shù)：95.0℃ for 30s，95.0℃ for 10s，60.0℃ for 30s Plate Read，GOTO 2，40 reps，Melt Curve 70℃to 95℃：Increment 0.5℃ for 5s Plate Read。分別檢測不同組 CSA兔 PI-3K、AKT、VEGF mRNA的變化。

1.6 統(tǒng)計學方法 測定的數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包建立實驗結果數(shù)據(jù)庫并進行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用雙側檢驗，符合正態(tài)性和方差齊性的資料，采用單因素方差（ANOVA）分析；P＜0.01或P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 激光針刀對CSA兔體質(zhì)量的影響 造模后三組CSA模型兔出現(xiàn)不同程度的精神萎靡或縮肩拱背、活動減少等情況，針刺組和激光針刀組兔經(jīng)治療后，一般情況有不同程度的改善。隨著飼養(yǎng)時間的增加，正常組兔體質(zhì)量呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢。造模后14d（治療前），與正常組比較，三組CSA模型兔體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05）。造模后24天（治療10天后），模型組兔體質(zhì)量明顯低于正常組（P＜0.01），針刺組、激光針刀組兔體質(zhì)量與正常組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，針刺組、激光針刀組兔體質(zhì)量明顯高于模型組（P均＜0.05）。造模后34天（治療20天后），模型組兔體質(zhì)量明顯低于正常組（P＜0.01），針刺組、激光針刀組兔體質(zhì)量與正常組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），與模型組比較，針刺組與激光針刀組兔體質(zhì)量均明顯高于模型組（P均＜0.01）。見表 1。

2.2 激光針刀對CSA兔PI-3K mRNA表達的影響

治療結束后，采用real-time PCR法檢測各組兔右側頸動脈PI-3K mRNA平均表達量結果如表2所示。與正常組比較，模型組兔頸動脈PI-3KmRNA表達明顯低于正常組（P＜0.01），針刺組和激光針刀組與正常組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。針刺組和激光針刀組兔頸動脈PI-3KmRNA表達明顯高于模型組（P＜0.05、P＜0.01），針刺組與激光針刀組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表 2。

表1 四組新西蘭白兔不同時間點體質(zhì)量比較（kg，x±s）

表2 四組新西蘭白兔右側頸動脈PI-3K mRNA表達量比較（x±s）

3 討論

本研究沿用經(jīng)典CSA模型制備CSA模型兔，發(fā)現(xiàn)實施造模后，與正常組相比模型組明顯出現(xiàn)活動減少、反應遲鈍、弓背卷縮、皮毛色澤變差，飲水量和進食量降低，大便稀溏，耳、舌顏色暗紫。造模完成后與空白組相比，模型組兔行為學改變，血流速度顯著降低，與正常組比較差異有統(tǒng)計學意義（另文發(fā)表），表明CSA實驗模型造模成功。

激光針刀設備簡單、操作簡便，有效地避免了對身體造成創(chuàng)傷，治療效果好，且無毒副作用，患者易于接受，由于技術較新穎因此目前用于CSA的治療仍不多見。邵燕[11]等發(fā)現(xiàn)激光對微血管的新生有誘發(fā)作用，其機制與PI3K激活密切相關。Al Rashoud等[12]采用激光針刀治療膝關節(jié)骨性關節(jié)炎，認為激光針刀能促使毛細管擴張和改善局部血液循環(huán)，提高痛閾，達到鎮(zhèn)痛效果，同時還具有明顯的消炎作用，從而減輕患者疼痛，改善生活質(zhì)量。Huang等[13]采用激光針刀治療顳下頜關節(jié)紊亂病，也發(fā)現(xiàn)激光照射可緩解疼痛、放松肌肉和促進血液循環(huán)，并能調(diào)節(jié)新陳代謝，改變組織病理狀態(tài)和促進組織健康的恢復，而且安全高效無副作用。激光針刀本質(zhì)上是一種能量轉(zhuǎn)化和傳遞的過程，經(jīng)激光照射的組織吸收了一定的光子后，將光能轉(zhuǎn)化為熱能，使局部溫度升高，擴張血管并促進血管新生，改善血液循環(huán)，恢復血液動力平衡，促進新陳代謝。由于CSA的主要病因為錐-基底動脈供血不足導致局部腦血流量的降低，故從理論上來講激光針刀尤其適用于CSA的治療。

PI-3K是胞內(nèi)具有催化活性的信號蛋白，其激活的結果是在質(zhì)膜上產(chǎn)生第二信使PIP3，PIP3與細胞內(nèi)含有PH結構域的信號蛋白AKT和PDK1結合，促使PDK1磷酸化AKT蛋白的Ser308導致AKT活化，形成PI-3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路[14-15]。AKT磷酸化和滅活結節(jié)硬化性因子2，因此誘導活性Rheb形成[16]，Rheb反過來磷酸化活化哺乳動物雷帕霉素靶蛋 白 （Mammalian target of rapamycin，mTOR）[17]，mTOR可直接增強（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）的轉(zhuǎn)錄活性導致其轉(zhuǎn)移至細胞核中，與結構性亞基HIF-1β形成HIF-1異二聚體復合物而活化，再與HIF-1α靶基因中的低氧反應元件結合調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄活性[18]。HIF-1α所調(diào)節(jié)的靶基因主要功能為促進血管生成增加局部氧流量。VEGF是血管內(nèi)皮細胞特異性的肝素結合生長因子，為目前已鑒定出來的30多種與血管生成相關的因子中最重要的因子。在低氧條件下，VEFG可被HIF誘導而轉(zhuǎn)錄激活[19]，其生物作用主要體現(xiàn)在兩方面：（1）促進血管內(nèi)皮細胞的分裂和增殖，從而生成新生血管[20]；（2）作為血管通透因子可以增加微血管的通透性[21]。從本項目階段性研究結果來看，激光針刀復合療法治療CSA的主要機制可能是通過PI3K-AKT-VEGF信號通路刺激椎動脈微血管的生成，從而有效改善椎動脈血管的血液循環(huán)狀況，改變由于CSA導致的椎動脈血流動力學異?，F(xiàn)象，從而改善局部血供。