蟹黃糖蛋白提取工藝及抗氧化活性研究

薛 然，杜 明，鄭 斌,2，相興偉，2，聞?wù)?，曲有?/p>

(1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江省海洋開發(fā)研究院，浙江舟山 316021)

海蟹，即三疣梭子蟹Portunus trituberculatus，屬甲殼動(dòng)物，是深受我國消費(fèi)者喜愛的特色水產(chǎn)品之一。由于海蟹特殊的生理特性——對自然繁殖條件和生存環(huán)境要求很高。我國處于亞熱帶和溫帶，氣候適宜，有利于蟹類的生長繁殖，主要盛產(chǎn)于遼東半島、山東半島及江浙閩粵沿海一帶[1-2]。海蟹不僅是鮮美佳肴——而且藥用價(jià)值豐富，其性味咸、寒，具有清熱散血——養(yǎng)筋益氣的功效[2]。雌蟹性成熟后的卵巢和肝臟部分俗稱“蟹黃”[3]。已有相關(guān)研究證明，蟹黃含有豐富的脂肪、蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、鈣質(zhì)等[4]。

糖蛋白是一類蛋白質(zhì)與糖共價(jià)結(jié)合的復(fù)合物[5]，其中糖鏈和肽鏈共同調(diào)節(jié)機(jī)體的各種生物活性[6]。已有研究表明翡翠貽貝糖蛋白[7]、蒲公英糖蛋白[8]、霍山石斛糖蛋白[9]等具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤活性。目前，蟹黃的研究多集中在營養(yǎng)成分分析比較，以及其作為食品的加工工藝及配方研究等方面[10-11]，對蟹黃的化學(xué)成分和生理活性研究較少，YANG Fang,et al[12]等人研究用含NaCL 的磷酸緩沖溶液提取蟹肉的肌原纖維蛋白；陶學(xué)明[13]采用酶解法從梭子蟹下腳料中提取蛋白質(zhì)，但有關(guān)蟹黃糖蛋白的提取及其活性研究在國內(nèi)外均未有相關(guān)文章發(fā)表。本實(shí)驗(yàn)將嘗試?yán)名}提取技術(shù)從梭子蟹的蟹黃中提取糖蛋白，探討其最佳提取工藝和抗氧化活性，對于更好地開發(fā)利用蟹黃這一寶貴的資源意義深遠(yuǎn)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

蟹黃:為新鮮梭子蟹蟹黃,由浙江省海洋研究開發(fā)院贈(zèng)送。

氯化鈉、無水乙醇、無水乙醚、濃硫酸、丙酮、苯酚等試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純;抗壞血酸（Vc）購于Sigma,分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

中藥粉碎機(jī)(103 型):瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司;大容量低速離心機(jī)(TD5K 型):長沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;恒溫水浴鍋(HH-S 型):鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司;紫外-可見分光光度計(jì)(UV-1600 型):上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蟹黃粗糖蛋白提取工藝

取一定量的蟹黃冷凍干燥，粉碎，過篩除雜。稱取蟹黃粉末1 g，按一定液料比加入不同濃度的NaCL溶液中，置于4℃條件下，浸提一段時(shí)間后，離心，取上清液，加入無水乙醇，使醇含量為70%，沉淀過夜，抽濾，依次用無水乙醇、丙酮洗滌2 次，揮干溶劑后，加少量水使其溶解，用Sevage 試劑(3 次)脫去蛋白[14]，濃縮后加入乙醇進(jìn)行二次醇沉。同樣，沉淀依次用乙醇、丙酮淋洗2 次，揮干溶劑，加少量蒸餾水溶解，流水透析，進(jìn)行冷凍干燥，即為蟹黃粗糖蛋白[15]。

1.3.2 蟹黃粗糖蛋白提取的單因素試驗(yàn)

稱取1 g 蟹黃粉末，按照鹽濃度(0.1～0.6 mol·L-1)、提取時(shí)間(1～6 h)、料液比(1:30～1:55) 3 個(gè)因素依次進(jìn)行試驗(yàn)，每組重復(fù)3 次，凍干后獲得蟹黃粗品，計(jì)算其占蟹黃原料的質(zhì)量百分比作為蟹黃糖蛋白提取率，并以提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出單因素試驗(yàn)條件。

1.3.3 蟹黃粗糖蛋白提取的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取鹽濃度(A)、時(shí)間(B)、料液比(C) 3 個(gè)因素，每個(gè)因素3 個(gè)水平，進(jìn)行蟹黃糖蛋白的L9(34)正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1。

表1 蟹黃糖蛋白提取的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 Experimental design of microwave extraction of crab spawn glycoprotein

1.4 蟹黃糖蛋白中多糖含量的測定

多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法[16]，以D-無水葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品。

配制濃度為0.1 mg·L-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，分別精確吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，加蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL，加入1.0 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的苯酚，搖勻后迅速加入5 mL 濃硫酸，室溫放置30 min，于波長490 nm 處測定吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，待測樣品稀釋若干倍后以同樣的方法測定吸光度。

多糖含量計(jì)算公式如下:

多糖含量/%=(m×D×V/M)×100%

式中:m 為樣品液OD 值對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得多糖含量，mg·mL-1;D 為稀釋倍數(shù);V 為樣品液總體積，mL;M 為加入的蟹黃干粉質(zhì)量，mg。

1.5 蟹黃糖蛋白中蛋白質(zhì)含量的測定

蛋白含量的測定采用福林酚比色法[17]，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。

配制濃度為0.249 g·L-1的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，分別精確吸取0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL 的標(biāo)準(zhǔn)液，加蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL，加入1.0 mL 堿性銅溶液搖勻后，迅速加入4 mL 福林酚溶液，混勻55℃水浴5 min 后冷卻至室溫，于波長650 nm 處測定吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，待測樣品稀釋若干倍后以同樣的方法測定吸光度。

蛋白含量計(jì)算公式如下:

蛋白含量/%=(m×D×V/M)×100%

式中:m 為樣品液OD 值對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得蛋白含量，mg·mL-1;D 為稀釋倍數(shù);V 為樣品液總體積，mL;M為加入的蟹黃干粉質(zhì)量，mg。

1.6 蟹黃糖蛋白的體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.6.1 溶液配制

蟹黃糖蛋白溶液:稱取一定量的蟹黃糖蛋白凍干粉沫，充分溶解于蒸餾水中，并依次稀釋到10、8、6、4、2 mg·mL-1。

Vc 溶液:稱取一定量Vc——充分溶解于蒸餾水中，并依次稀釋到10、8、6、4、2 mg·mL-1。

1.6.2 抗脂質(zhì)過氧化能力的測定

抑制率=(A對照-A樣品)/A對照×100%

式中:A對照為不加樣品管的吸光度;A樣品為蟹黃糖蛋白溶液的吸光度。

1.6.3 DPPH 自由基清除能力的測定

測定方法[19]如下:取試管編號(hào)，分別加入1 mL 不同濃度(0，2，4，6，8 和10 mg·mL-1)糖蛋白溶液和4 mL 0.004% DPPH，搖勻后暗處放置30 min 后，以無水乙醇為對照管，在517 nm 處測定吸光度，以Vc 溶液作為陽性對照。

清除率=[(A對照-A樣品)/A對照]×100%

式中:A對照為無水乙醇的吸光度;A樣品為蟹黃糖蛋白溶液的吸光度。

1.6.4 超氧陰離子自由基清除能力的測定

測定方法[20]如下：取試管編號(hào)，依次加入3 mL Tris-HCl (0.05 mol·L-1，pH 為8.2)緩沖液和0.2 mL 的不同濃度(0、2、4、6、8 和10 mg·mL-1)蟹黃糖蛋白溶液，25℃水浴10 min 后，依次加入0.012 mL 濃度為30 mmol·L-1鄰苯三酚溶液，晃動(dòng)試管搖勻后，室溫下放置4 min，之后依次加入0.5 mL 濃鹽酸溶液停止反應(yīng)，測定320 nm 處吸光度，以Vc 溶液作為陽性對照。

清除能力=(A1-A2)/(A1-A0)×100%。

式中:A0為加Tris-HCl 緩沖液的吸光度;A1為加蒸餾水的吸光度;A2為蟹黃糖蛋白溶液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟹黃糖蛋白中的多糖含量和蛋白含量

苯酚-硫酸法測得多糖含量為74.60%±1.3%，福林酚比色法測得蛋白含量為16.25%±0.73%。

1.2.6.1 DNA提取 采取磁珠法利用致善Lab-Aid 820全自動(dòng)核酸提取儀抽提目標(biāo)外周血、羊水gDNA。通過Nanodrop微量紫外分光光度計(jì)將提取完的gDNA進(jìn)行純度和濃度檢測，保證其A260/A280在1.8～2.0之間且總量達(dá)到單次建庫量5 μg。

2.2 蟹黃糖蛋白提取的單因素試驗(yàn)優(yōu)化

2.2.1 鹽濃度對蟹黃糖蛋白提取率的影響

從圖1 可以看出：鹽溶液濃度在0～4mol·L-1范圍內(nèi)，蟹黃糖蛋白的提取率隨著鹽濃度的增加而增大；在鹽濃度為0.4 mol·L-1達(dá)到最高提取率為4.94%;當(dāng)鹽濃度超過0.4 mol·L-1時(shí)，糖蛋白提取率有所下降，可能是由于此時(shí)提取溶劑濃度達(dá)到飽和狀態(tài)，因此選擇提取鹽濃度為0.4 mol·L-1。

2.2.2 提取時(shí)間對蟹黃糖蛋白提取率的影響

從圖2 可以看出：提取時(shí)間在1～5 h 范圍內(nèi)，蟹黃糖蛋白提取率隨著時(shí)間的延長而相應(yīng)提高，這是由于隨著浸提時(shí)間延長，糖蛋白溶解越來越充分，溶出量也逐漸增多[21]，所以糖蛋白提取率增加。其中在5 h時(shí)提取率達(dá)到最大5.09%，所以選擇提取時(shí)間為5 h。

2.2.3 蟹黃與鹽溶液的料液質(zhì)量比對蟹黃糖蛋白提取率的影響

從圖3 可以看出：在一定的范圍內(nèi)，蟹黃糖蛋白提取率隨著料液質(zhì)量比的增大而提高，是因?yàn)榇藭r(shí)細(xì)胞內(nèi)外濃度差變大，胞內(nèi)浸出物增多[22]。當(dāng)料液質(zhì)量比為1:45 時(shí)，糖蛋白提取率達(dá)到最大為3.96%，當(dāng)液固質(zhì)量＞1:45 時(shí)，提取率呈小幅度下降，可能是糖蛋白基本都溶出完全的原因，所以選擇提取料液比為1:45。

圖1 鹽濃度對蟹黃糖蛋白提率的影響Fig.1 Effect of salt concentration on the extraction rate of crab spawn glycoprotein

圖2 提取時(shí)間對蟹黃糖蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of crab spawn glycoprotein

圖3 料液質(zhì)量比對蟹黃糖蛋白提率的影響Fig.3 Effect of ratio of material to liquid on the extraction rate of crab spawn glycoprotein

2.3 蟹黃糖蛋白提取工藝的正交試驗(yàn)優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對影響蟹黃糖蛋白提取率的主要因素(鹽濃度、時(shí)間、料液比)進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果如表2。

由表2 可知——RB＞RA＞RC，各因素對糖蛋白提取率的影響程度依次為時(shí)間(B)＞鹽濃度(A)＞料液比(C)，由均值比較可知:鹽濃度的均值最大為K2，時(shí)間的均值最大為K3，料液比的均值最大為K2，所以最優(yōu)工藝為A2B3C2，即正交試驗(yàn)的最佳工藝為鹽濃度0.4 mol·L-1，浸提時(shí)間5 h，料液比為1:45。

表2 蟹黃糖蛋白正交試驗(yàn)的結(jié)果Tab.2 Results of orthogonal test of crab spawn glycoprotein

由表3 可知，F(xiàn)B=37.703＞FA=22.541＞FC=11.054，同時(shí)查表可知，鹽濃度、浸提時(shí)間對蟹黃糖蛋白提取率有顯著影響，料液比對蟹黃糖蛋白提取率無顯著影響。

表3 試驗(yàn)因素的顯著性分析Tab.3 Significant analysis of experimental factors

2.4 蟹黃糖蛋白的體外抗氧化活性

2.4.1 抗脂質(zhì)過氧化能力的測定

從圖4 可以看出，蟹黃糖蛋白濃度在0～10 mg·mL-1間時(shí)，隨著糖蛋白濃度的增加，抑制率逐漸升高即抗脂質(zhì)過氧化能力逐漸增強(qiáng)。當(dāng)糖蛋白濃度低于4 mg·mL-1時(shí)，抑制率隨著濃度增加急劇升高;糖蛋白濃度高于4 mg·mL-1時(shí)，抑制率增長緩慢。糖蛋白濃度達(dá)到10 mg·mL-1時(shí)，抑制率達(dá)到55.37%。

2.4.2 DPPH 自由基清除能力的測定

從圖5 可以看出，蟹黃糖蛋白具有一定的DPPH 自由基清除能力，當(dāng)糖蛋白濃度低于4 mg·mL-1時(shí)，清除率隨著濃度增加急劇升高;糖蛋白濃度在4～8 mg·mL-1間時(shí)，清除率曲線趨于平坦；糖蛋白濃度高于8 mg·mL-1時(shí)，清除率呈現(xiàn)上升趨勢。

2.4.3 超氧陰離子自由基清除能力的測定

從圖6 可以看出，蟹黃糖蛋白濃度在0～10 mg·mL-1間時(shí)，隨著蟹黃糖蛋白濃度增加，清除率逐漸升高，即超氧陰離子自由基清除能力逐漸增強(qiáng)，但相比于抗脂質(zhì)過氧化能力、DPPH自由基清除能力較弱。當(dāng)蟹黃糖蛋白濃度為10 mg·mL-1時(shí)，超氧陰離子自由基清除率達(dá)到52.94%。

圖4 蟹黃糖蛋白的抗脂質(zhì)過氧化能力Fig.4 Anti-lipid peroxidation ability of crab spawn glycoprotein

圖5 蟹黃糖蛋白的DPPH 自由基清除能力Fig.5 DPPH free radical scavenging ability of crab spawn glycoprotein

圖6 蟹黃糖蛋白的超氧陰離子自由基清除能力Fig.6 Superoxide anion free radical scavenging ability of crab spawn glycoprotein

3 結(jié)論

(1)在前期的單因素試驗(yàn)優(yōu)化蟹黃糖蛋白提取率的條件下，通過L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝得出，最優(yōu)方案為A2B3C2 即鹽濃度為0.4 mol·L-1，浸提時(shí)間5 h，料液比為1:45。同時(shí)，方差分析表明:鹽濃度、提取時(shí)間對蟹黃糖蛋白提取率影響顯著。

(2)以Vc 作為對照組，通過對蟹黃糖蛋白的抗脂質(zhì)過氧化能力、DPPH 自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力來評(píng)價(jià)其體外抗氧化活性，結(jié)果表明蟹黃糖蛋白具有一定的體外抗氧化活性，但弱于Vc 抗氧化能力。