梅魚魚鰾膠原蛋白的制備及抗疲勞活性實驗

王豐雷，徐寶貴，徐 敏，吳飛紅，楊最素，丁國芳

(1.海力生集團(tuán)有限公司，浙江舟山 316013；2.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山 316022)

梅魚Callichthys lucidus 屬于脊索動物門，硬骨魚綱，鱸形目鱸總科，是溫水性近底層的小型經(jīng)濟(jì)魚類，產(chǎn)量較大，是我國海洋遠(yuǎn)近海域捕撈的海產(chǎn)品之一。梅魚亦稱“梅大頭”，味道極其鮮美，以鮮食、冷凍或加工成干品為主[1]。隨著近年來對延長梅魚貨架期的要求和凈菜市場的需求擴(kuò)大，水產(chǎn)企業(yè)對梅魚的精細(xì)加工不斷增加，而加工后的下腳料如魚鰾，常作為廢料處理，無法有效利用。我國食用魚鰾有著悠久的歷史，有“海洋人參”譽(yù)稱，魚鰾中含有高級膠原蛋白、多種維生素、粘多糖及鈣、鋅、鐵、硒等多種微量元素，其中蛋白質(zhì)一般在80%以上，而脂肪含量低，是較理想的高蛋白低脂食品。近年來學(xué)者們對海魚魚鰾的的研究日益增加，從鮸魚、大黃魚、鰹魚、日本黃姑魚等魚鰾中提取了膠原蛋白及膠原蛋白肽，發(fā)現(xiàn)具有較好的抗氧化活性、提高小鼠記憶、促進(jìn)創(chuàng)傷皮膚的修復(fù)等功能[2-5]，并研制了魚鰾營養(yǎng)液、魚鰾膠原蛋白果凍等營養(yǎng)食品[6-8]，也有學(xué)者利用魷魚皮膠原蛋白模擬加工成魚鰾[9]。任玉翠等[10]、曾麗[11]根據(jù)“保健食品的功能學(xué)評價程序和方法”，發(fā)現(xiàn)海魚魚鰾的提取物對小鼠具有較好的抗疲勞活性，可作為滋補(bǔ)品進(jìn)行開發(fā)。然目前對梅魚魚鰾膠原蛋白的提取及抗疲勞活性尚未見報導(dǎo)。膠原蛋白的提取有熱水法、酸法、堿法、酶法等，而應(yīng)用胃蛋白酶提取得到的膠原蛋白結(jié)構(gòu)最完整[12]，因此本研究采用胃蛋白酶提取梅魚魚鰾膠原蛋白，并檢測其對小鼠體內(nèi)的抗疲勞活性，為梅魚魚鰾膠原蛋白的開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

雄性ICR 健康小鼠，體重為18～22 g，購置于浙江省實驗動物中心，飼養(yǎng)于浙江海洋大學(xué)實驗動物房。

1.1.2 實驗原料與試劑

新鮮梅魚魚鰾購于舟山市南珍菜場，剝離魚鰾內(nèi)壁的血管及結(jié)締組織，經(jīng)組織搗碎機(jī)搗碎后，小劑量分裝后于-20℃冷凍備用。胃蛋白酶(1：3 000)：美國SIGMA 公司；次高分子量Marker(43 000～200 000 D)：中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；L-羥脯氨酸：上海朝暉生物科技有限公司；血清尿素氮試劑盒、肝糖原試劑盒、肌糖原試劑盒：南京建成生物工程研究所；其它所用試劑：國藥試劑分析純。

1.1.3 儀器

BSA124S 型電子天平：Sartorius AG 公司；RE-2000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；DS-1 型高速組織搗碎機(jī)：上海標(biāo)本模型廠；RLPHR 1-4LD 冷凍干燥機(jī)：德國Christ 公司；垂直電泳儀：美國伯樂公司IRPrestige-21 傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜儀：日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 梅魚魚鰾膠原蛋白的制備

1.2.1.1 梅魚魚鰾膠原蛋白的提取工藝

選用胃蛋白酶進(jìn)行酶解，考慮到A(料液比)、B(酶解溫度)、C(酶解時間)和D(加酶量)4 個因素，進(jìn)行L9(34)的正交試驗(具體設(shè)定值如表1)，比較在不同酶解條件下膠原蛋白的提取率，以達(dá)到胃蛋白酶法提取膠原蛋白的工藝優(yōu)化。

酶解具體工藝流程如下：

魚鰾洗凈→除去其內(nèi)壁血管及結(jié)締組織→0.1 mol·L-1的NaOH 除去雜蛋白→10%的正丁醇溶液除脂→加酶水解→滅酶(終濃度為20±1 mmol·L-1的EDTA)→離心(5 000 r·min-1，15 min)→除色素(活性炭)→過濾得到酶解液→沉淀在相同條件下再次酶解→合并兩次酶解液離心(10 000 r·min-1，30 min)→透析(蒸餾水)→離心(12 000 r·min-1，30 min)→取上清液→濃縮→冷凍干燥。

表1 胃蛋白酶提取魚鰾膠原蛋白的因素與水平設(shè)定值Tab.1 The factors and levels of collagen which extracted from swim bladders by pepsin

1.2.1.2 樣品中膠原蛋白含量的測定

采用羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定。分別取濃度為1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、2.5 μg·mL-1、3.0 μg·mL-1、3.5 μg·mL-1、4.0 μg·mL-1、4.5 μg·mL-1的羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL 于試管中，相繼加入0.05 mol·L-1氯胺T溶液、檸檬酸緩沖液(pH 6.0)各1 mL，混勻后在室溫下氧化10 min，再加入高氯酸(3.5 mol·L-1) l mL，混勻后在室溫下放置10 min，加入l mL 對二甲基氨基苯甲醛溶液顯色，振蕩混勻后將其放至65℃水浴鍋中，反應(yīng)20 min，于560 nm 處測OD 值。橫坐標(biāo)為羥脯氨酸的濃度，縱坐標(biāo)為所測得的OD 值，繪制羥脯氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線并建立線性回歸方程。

1.2.1.3 魚鰾和所得膠原蛋白中羥脯氨酸含量的測定

取魚鰾1 g，加入50 mL 6 mol·L-1的鹽酸，置于120℃電熱套中水解10 h。水解液冷卻后定容至100 mL后抽濾，取濾液1 mL，稀釋50 倍后調(diào)節(jié)pH 至7.0，轉(zhuǎn)移到容量瓶中并定容至100 mL。取冷凍干燥好的膠原蛋白粗品0.01 g，加入20 mL 6 mol·L-1的鹽酸和20 mL 蒸餾水，置于120℃的電熱套中水解7.5 h。取魚鰾和膠原蛋白水解液1 mL 于試管中，按上述的方法，分別計算魚鰾原料中羥脯氨酸的含量和樣品中的膠原蛋白含量。

膠原蛋白的提取率=(粗品中羥脯氨酸的總質(zhì)量)/(對應(yīng)質(zhì)量的魚鰾羥脯氨酸的總質(zhì)量)

1.2.1.4 膠原蛋白性質(zhì)的確定

采用SDS -PAGE 垂直電泳，電泳緩沖液為Tris -甘氨酸緩沖液。

1.2.1.5 傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜儀檢測(FTIR)

取1 mg 凍干的梅魚膠原蛋白粗提取物與脫水處理后的KBr(分析純) (二者比值為1 :100)充分研磨混勻，放入相應(yīng)模具壓制成KBr 片。在400～4 000 cm-1的條件下測定其FTIR。掃描條件設(shè)置為：分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)40 次。

1.2.2 魚鰾膠原蛋白體內(nèi)抗疲勞實驗

1.2.2.1 實驗動物分組

健康雄性ICR 小鼠64 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后，隨機(jī)分成空白對照組、梅魚魚鰾膠原蛋白低劑量組、中劑量組和高劑量共4 組，每組16 只。每天定時給小鼠灌胃，空白對照組只給等量生理鹽水，魚鰾膠原蛋白低劑量組、中劑量組和高劑量灌胃劑量分別是50 mg·kg-1·d-1、100 mg·kg-1·d-1和200 mg·kg-1·d-1，喂食劑量均為0.2 mL。實驗期間，進(jìn)食和飲水自由，連續(xù)28 d。在小鼠開始灌胃的第1 天及最后1 天稱其體重。

1.2.2.2 小鼠負(fù)重游泳實驗

在4 組動物中每組隨機(jī)抽取8 只小鼠，在最后一次灌胃給藥后30 min，標(biāo)記稱重后用于小鼠負(fù)重游泳實驗。自制50 cm×50 cm×35 cm 的游泳箱,在小鼠尾根部系上自身體重5%的鉛絲,遂將其放入水深30 cm、水溫為25±1℃的游泳箱中。用玻璃棒不間斷攪動游泳箱中的水，以保證小鼠在游泳箱中能不停地游動，至完全疲勞狀態(tài)。當(dāng)小鼠頭部沒入水中10 s 后，始終不能正常把頭伸出水面，則認(rèn)為此時小鼠已進(jìn)入力竭狀態(tài)，記錄小鼠從開始進(jìn)入水面游泳到力竭狀態(tài)的時間為力竭游泳時間。

1.2.2.3 3 項生理指標(biāo)的測定

每組剩下的8 只小鼠，用于檢測血清尿素氮含量、肝糖原和肌糖原含量這3 項生理指標(biāo)。小鼠在最后一次灌胃給藥30 min 后，在游泳箱中游泳60 min，休息45 min 后進(jìn)行眼球取血，用于測定血清尿素氮的含量?？焖偃〕龈闻K用于測肝糖原的含量，取小鼠腓腸肌用于肌糖原含量的測定，具體步驟按試劑盒操作說明。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，計量數(shù)據(jù)以±SD 表示，組間差異采用t 檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Hydroxyproline standard curve

2 結(jié)果

2.1 魚鰾膠原蛋白的制備

2.1.1 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

如圖1 顯示為羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定結(jié)果，羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為：Y=0.058 1 X+0.002 4。羥脯氨酸質(zhì)量濃度與吸光度之間的相關(guān)系數(shù)為R2=0.998 7，這一結(jié)果表明吸光度值與羥脯氨酸濃度之間有著良好的相關(guān)性。

2.1.2 魚鰾羥脯氨酸含量的測定

經(jīng)計算得新鮮梅魚魚鰾中羥脯氨酸的含量為1.16 %。

2.1.3 魚鰾膠原蛋白的酶解工藝結(jié)果

按照1.2.1.1 的方法和L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗，梅魚魚鰾正交試驗結(jié)果如表2。

表2 魚鰾酶解工藝的正交試驗結(jié)果Tab.2 Orthogonal experimental results of enzymatic hydrolysis of swim bladders

從表2 的的實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：以羥脯氨酸含量計算膠原蛋白提取率確定最佳酶解工藝，各因素對膠原蛋白提取率的影響程度依次為：酶解時間＞酶解溫度＞加酶量＞料液比，通過分析得出梅魚魚鰾膠原蛋白胃蛋白酶法提取的最佳提取工藝條件為A2B3C2D3，即以1.0 %的胃蛋白酶為提取劑，采用1：40 的料液比，在24℃條件下酶解36 h，其提取率最高，經(jīng)驗證實驗確定為63.96%。

2.1.4 SDS -PAGE 的電泳結(jié)果

魚鰾膠原蛋白經(jīng)SDS-PAGE 的電泳結(jié)果如圖2 所示。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，該膠原蛋白是由α 鏈(α1 和α2)，β 鏈，以及少量的γ 鏈組成的，其分子含有從44.3 kDa 到97.2 kDa 的大量低分子組分。此外梅魚魚鰾膠原蛋白中含有的α1 鏈和α2 鏈的比例約為2 :1，其分子量分別為為112～122 kDa 和187 kDa，這表明它屬于分子組成為[α1(I)]2α2(I)的I 型膠原蛋白。因為胃蛋白酶能消除蛋白分子間的交聯(lián)作用，同時作用于其端肽，因此，梅魚膠原蛋白中僅含有少量的較高分子組分，即γ 鏈，以及分子間和分子內(nèi)交聯(lián)組成。

2.1.5 傅里葉紅外光譜儀(FTIR)分析

梅魚魚鰾中膠原蛋白的FTIR 掃描圖譜如圖3 所示。從圖中可以看出，由N-H 的伸縮振動引起的振動波數(shù)為3 400～3 440 cm-1，此處振動為酰胺A 譜帶的特征振動，但當(dāng)多肽中的N-H 有氫鍵形成時，其振動波數(shù)會向低頻率偏移。因此膠原蛋白的酰胺A 帶的γN-H伸縮(氫鍵)振動是在3 314 cm-1處的吸收峰；膠原蛋白的酰胺B 帶的γC-H伸縮振動是在2 925 cm-1附近。由此得出，膠原蛋白的CH2為非對稱拉伸。

在2 000～1 500 cm-1為雙鍵區(qū)，通常情況下肽鏈側(cè)基對酰胺I 譜帶的影響基本沒有或不影響其頻率，在這一范圍內(nèi)的振動頻率只取決于肽鏈構(gòu)型。在1 653 cm-1處膠原蛋白出現(xiàn)酰胺I 帶的γC=O伸縮振動強(qiáng)峰，這一振動峰與蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。在1 544 cm-1處和在1 240 cm-1處是膠原蛋白酰胺Ⅱ帶的γN-H彎曲振動吸收峰和酰胺Ⅲ帶的γN-H 的變形峰。在1 460～1 240 cm-1附近的吸收峰證明所提膠原蛋白存在完整的3股螺旋結(jié)構(gòu)。結(jié)果提示所提取的梅魚魚鰾膠原蛋白基本保留了天然膠原蛋白的原有形態(tài)。FTIR 圖譜證明了胃蛋白酶僅對膠原蛋白的非螺旋區(qū)產(chǎn)生酶切作用，對膠原分子的螺旋區(qū)沒有破壞作用。此外FTIR 圖譜進(jìn)一步證明了本試驗所提取的膠原蛋白是I 型膠原蛋白，并且保持了膠原蛋白所特有的完整生物結(jié)構(gòu)。

2.2 魚鰾膠原蛋白體內(nèi)抗疲勞結(jié)果

2.2.1 ICR 小鼠的體重變化

小鼠連續(xù)灌胃魚鰾膠原蛋白4 周后，每組小鼠體重的變化結(jié)果如圖4所示。從圖中可以看出，各組小鼠體重雖然都有不同程度的增加，但各組之間沒有顯著性差異，說明魚鰾膠原蛋白對小鼠體重的影響沒有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2.2 小鼠負(fù)重游泳時間結(jié)果

用梅魚魚鰾膠原蛋白灌胃小鼠4 周，4 組小鼠負(fù)重游泳時間的測定結(jié)果如圖5。從圖5 可知，膠原蛋白實驗組與空白對照組相比，它們不同程度地延長了小鼠負(fù)重游泳的時間。其中，中劑量組和高劑量組的小鼠負(fù)重游泳平均時間分別為19.16 min 和21.20 min，中劑量組游泳時間延長了73.24 %，高劑量組游泳時間延長了91.69%，均有顯著性差異(P＜0.05)。低劑量組的小鼠負(fù)重游泳時間僅為16.4 min，比空白對照組增加了48.73%(P＞0.05)，沒有統(tǒng)計學(xué)差異。

2.2.3 3 項生理指標(biāo)的測定結(jié)果

圖2 梅魚魚鰾膠原蛋白電泳圖Fig.2 Electrophoresis of collagen from Redlip croker swim bladders

圖3 梅魚魚鰾膠原蛋白紅外掃描圖Fig.3 Infrared scan of collagen from redlip croker swim bladders

圖4 梅魚魚鰾膠原蛋白對小鼠體重的影響(n=8，±SD)Fig.4 Effects of collagen from redlip croker swim bladders on the weight of mice (n=8,±SD)

圖5 梅魚魚鰾膠原蛋白對小鼠負(fù)重游泳時間的影響(n=8，±SD)Fig.5 Effects of collgen from Redlip croker swim bladders loading forced swimming time of mice (n=8,±SD)

小鼠血清尿素氮、肝糖原、肌糖原的含量變化如表3 所示。從表3 中可以看出，各劑量組小鼠的血清尿素氮含量比空白對照組都有減少，中劑量組和高劑量組比空白對照組小鼠減少了23.88%和24.07%(P＜0.05)，均有顯著性差異；低劑量組小鼠比空白對照組減少了18.56%(P＞0.05)，沒有顯著性差異。各組肝糖原的含量均比空白對照組均有增加，高劑量組小鼠的肝糖原含量比空白對照組增多了114.38%(P＜0.05)；中劑量組和低劑量組肝糖原的含量比空白對照組增多了42.75%和31.19%，后二者沒有統(tǒng)計學(xué)意義。各組肌糖原的含量均比空白對照組增加，高劑量組比空白對照組增多了123.81%(P＜0.05)，差異具有顯著性；中劑量組和低劑量組肌糖原的含量比空白對照組增多了55.95%和40.87%，差異無顯著性。

表3 小鼠3 項生理指標(biāo)的含量變化(n=8，±SD)Tab.1 Effects of collgen from redlip croker swim bladders on serum urea nitrogen content(n=8,±SD)

表3 小鼠3 項生理指標(biāo)的含量變化(n=8，±SD)Tab.1 Effects of collgen from redlip croker swim bladders on serum urea nitrogen content(n=8,±SD)

注：與空白對照組相比，*P＜0.05.

3 討論與分析

提高水產(chǎn)品加工過程中廢棄物的高值化利用是近年來學(xué)者們關(guān)注的熱點。魚鰾是硬骨類魚加工過程中被丟棄的或低值利用的下腳料，但魚鰾具有相當(dāng)?shù)淖萄a(bǔ)作用和藥用價值，是一類非常重要的藥食兩用生物資源。魚膘中含有豐富的膠原蛋白，基于魚膘膠原蛋白的高營養(yǎng)、高保濕、低免疫活性和低的生物降解性,對其研究日益增多，可應(yīng)用于功能食品、化妝品、醫(yī)藥、生物材料等高附加值領(lǐng)域[13-15]。然目前對梅魚魚鰾的相關(guān)研究報道不多。

本實驗采用正交實驗的方法，應(yīng)用胃蛋白酶酶解提取梅魚魚鰾膠原蛋白，以羥脯氨酸含量作為提取率標(biāo)準(zhǔn)，考察了溫度，料液比，加酶量以及酶解時間對膠原蛋白提取率的影響，確定梅魚魚鰾最佳提取工藝為加酶量為1.0 %，料液比為1 ：30，酶解溫度為4℃，酶解時間為36 h，最高提取率為63.96%。通過SDS 凝膠電泳和紅外光譜圖檢測得到的膠原蛋白為I 型膠原蛋白，并且較好地保持其三級結(jié)構(gòu)，這將為后續(xù)梅魚魚鰾膠原蛋白的研究提供實驗依據(jù)。

膠原蛋白是動物體內(nèi)含量最豐富、分布最廣的蛋白質(zhì)，是與組織器官功能有關(guān)的功能性蛋白，具有支撐機(jī)體器官、保護(hù)組織等功能[16]。研究發(fā)現(xiàn)魚鰾膠原蛋白具有較好的抗疲勞活性[10-11]。疲勞是身體劇烈運動時產(chǎn)生的一種綜合性生理過程，持續(xù)的運動過程使肌肉的耗氧量增加、血糖下降及蛋白質(zhì)消耗，疲勞最主要的表現(xiàn)是運動耐力的下降，這是反映機(jī)體疲勞程度最直接和最客觀的指標(biāo)[17]。因此學(xué)者們特別是運動學(xué)家們越來越重視天然性抗疲勞功能食品的研究，為提高運動員的運動耐力，延緩疲勞發(fā)生，加快疲勞恢復(fù)，現(xiàn)已從海洋生物如螺旋藻、扇貝、牡蠣中研制出許多抗疲勞制品[18]。力竭游泳實驗是評價動物抗疲勞特性的常用指標(biāo)，小鼠力竭游泳時間與抗疲勞活性成正相關(guān)[19]；本實驗采用小鼠負(fù)重游泳試驗檢測梅魚魚鰾膠原蛋白的抗疲勞活性，發(fā)現(xiàn)灌胃膠原蛋白后的小鼠負(fù)重游泳時間明顯延長，特別是中劑量組和高劑量組的小鼠更明顯，說明梅魚魚鰾膠原蛋白具有較好的抗疲勞活性。

機(jī)體運動過程中提供能量的主要來源是肝糖原和肌糖原，它們含量的多少間接反映了有氧運動的能力。糖原的儲備增加能有效減少蛋白質(zhì)的氧化分解，保證了機(jī)體的正常代謝；肝糖原和肌糖原的含量變化是反映疲勞程度的重要指標(biāo)。血清尿素氮是蛋白質(zhì)代謝的產(chǎn)物，無氧情況下的蛋白質(zhì)代謝對機(jī)體是一種消耗，隨運動程度的加深尿素氮含量增加，負(fù)荷能力越差[20]。因此本實驗通過檢測小鼠運動后肝糖原、肌糖原和尿素氮的含量，進(jìn)一步衡量魚鰾膠原蛋白的抗疲勞活性。通過實驗發(fā)現(xiàn)，梅魚魚鰾膠原蛋白高劑量組能大幅度增加肝糖原、肌糖原的含量，降低血清尿素氮含量，因此認(rèn)為經(jīng)胃蛋白酶提取的梅魚膠原蛋白具有較好的抗疲勞活性，是值得開發(fā)利用的來自于海洋的可食性、低免疫原性膠原蛋白。