天然產(chǎn)物提取及其抗氧化測定設(shè)計實驗

楊玉琴 皇甫鑫強 李俊莉

一、天然產(chǎn)物提取及其抗氧化測定設(shè)計實驗的意義

資源、環(huán)境與持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略問題已成為人類社會所面臨的全球性熱點問題，要求人們必須高效精細地利用有用資源，其中，生物資源更由于其獨特性及重要的社會經(jīng)濟價值，其應(yīng)用開發(fā)廣布社會各個領(lǐng)域。我國有著獨特和豐富的天然植物資源，因而對其有效成分的分離和研究十分重要。植物在我國的應(yīng)用已達幾千年之久，甚至形成了獨特的中藥文化，并且總結(jié)出了中藥獨特的用藥方法，其有效性經(jīng)過了大量的臨床驗證，其科學(xué)性毋庸置疑。天然產(chǎn)物種類繁多，廣泛存在于自然界中且天然產(chǎn)物中化學(xué)物質(zhì)的研究和深加工利用具有重要的社會經(jīng)濟價值。

另一方面，由于環(huán)境的污染、添加劑濫用以及社會壓力增加等因素，人體內(nèi)的自由基數(shù)量激增，抗氧化系統(tǒng)的平衡遭到了破壞，過量的活躍自由基對人體細胞進行攻擊，細胞會受到損傷甚至死亡，研究表明很多重大疾病和衰老都與過量自由基的產(chǎn)生有關(guān)聯(lián)。然而使用合成抗氧化劑對人體健康有潛在危害，如二丁基羥基茴香醚（BHA）在動物實驗中是致癌的，因此在植物中尋找安全的天然抗氧化物質(zhì)及其應(yīng)用的研究工作引起了人們的重視。植物中提取的抗氧化活性成分主要有多糖類化合物、黃酮類化合物、多酚類化合物、生物堿、皂苷類、維生素等。研究天然植物抗氧化活性成分的提取及檢測方法，對新型抗氧劑的開發(fā)及抗氧劑抗氧機理的研究具有重要的意義。

二、抗氧化測定原理

1.DPPH自由基清除法

DPPH法于1958年被提出，廣泛用于定量測定生物試樣和食品的抗氧化能力。DPPH自由基存在不成對電子，其無水乙醇溶液呈紫色，在517 nm處有最大吸收。DPPH比色法主要利用自由基清除劑提供一個電子與DPPH自由基的故對電子配對，使自身紫色變?yōu)辄S色，在517 nm波長處的吸光度變小，其變化程度與自由基清除程度呈線性關(guān)系，即清除自由基能力越強，吸光度越小。

2.HO·自由基清除法

利用芬頓反應(yīng)，讓二價鐵離子（Fe2+）和過氧化氫之間的鏈反應(yīng)生成羥基自由基（HO·），羥基自由基具有極強的得電子能力，可氧化水楊酸產(chǎn)生在510nm處有吸收的有色物質(zhì)。有自由基清除劑存在時將消耗羥基自由基，通過測定水楊酸被羥自由基氧化所得到的產(chǎn)物，可以確定HO·自由基的清除率。

3.超氧陰離子清除

超氧陰離子自由基作為生物體代謝過程中產(chǎn)生的一種自由基，與機體衰老和各種疾病有很密切的關(guān)系，因此測定超氧陰離子自由基清除能力有很重要的意義，可采用鄰苯三酚自氧化法測定待測液清除超氧陰離子的能力。在弱堿性條件下，鄰苯三酚能發(fā)生自氧化反應(yīng)，生成超氧陰離子和有色中間產(chǎn)物，該中間產(chǎn)物在320nm處有一特征吸收峰。當(dāng)加入超氧陰離子清除劑時，它能迅速與超氧陰離子反應(yīng)，從而阻止中間產(chǎn)物的積累，使溶液在320nm處光吸收減弱。故可以通過測定吸光度值來評價清除劑對超氧陰離子的清除作用。

4.總還原能力測定

還原能力測定的原理是：

K3[Fe（CN）6]+樣品→K4[Fe（CN）6]+樣品氧化物

K4[Fe（CN）6]+Fe3+→Fe4[Fe（CN）6]3

在波長700nm處測定吸光度A，A值越大，表示樣品的還原能力越強。

三、實驗方案

確定本次實驗設(shè)計的目的：了解天然產(chǎn)物分離、提純的基本方法;了解天然產(chǎn)物有效成分的基本應(yīng)用;了解并掌握天然產(chǎn)物提取的基本操作;了解天然產(chǎn)物成分用于抗氧化測定的基本方法;加深對實驗技能的掌握及提高查閱文獻資料的能力。

實驗室提供的具體條件：常規(guī)玻璃儀器、超聲儀、天平、水浴鍋、紫外分光光度計、及氧化測定的常規(guī)試劑及其他可能使用到試劑（提前檢查設(shè)計方案以確定儀器及試劑情況）。

實驗流程：給定實驗名稱（說明實驗背景和要求，明確實驗要求）→確定提取物→收集原料并進行預(yù)處理→查閱資料確定提取目標(biāo)產(chǎn)物根據(jù)產(chǎn)物特點確定該抗氧化活性成分的提取方法→初步完成實驗設(shè)計方案，連同預(yù)處理的原料交由指導(dǎo)教師檢查通過→進行實驗→分析→總結(jié)。

四、實驗評分與效果

以往實驗往往根據(jù)實驗過程中的操作及其實驗數(shù)據(jù)結(jié)果給出得分，在我們的評價體系中，傳統(tǒng)評價只占實驗評分中的一部分。由于實驗時間安排在大三下學(xué)期，在實驗中本就有意引導(dǎo)學(xué)生將在前面學(xué)習(xí)的無機、有機、分析等分類學(xué)習(xí)實驗課程中的的基本知識和基本技能加以綜合運用融會貫通，達到在高層次上對知識的整體把握和靈活應(yīng)用，所以實驗評分系統(tǒng)中的總結(jié)與分析占據(jù)主導(dǎo)。更重要的是，通過獨立設(shè)計完成實驗，加強了學(xué)生運用所學(xué)知識分析和解決實際問題，有利于培養(yǎng)學(xué)生進行科學(xué)研究的能力和態(tài)度，為后續(xù)的畢業(yè)論文工作打下堅實的基礎(chǔ)，故需要學(xué)生在總結(jié)與分析給出實驗存在的問題，尤其是對該實驗的后續(xù)開展做出分析給出可以繼續(xù)進行實驗的方案，依據(jù)學(xué)生提供出的可行性變量因素進行評分，這也使得有的課題延伸成為了學(xué)生的畢業(yè)論文。完成設(shè)計實驗后再寫畢業(yè)論文，可以提高學(xué)生在畢業(yè)論文工作中的創(chuàng)新能力和綜合水平，提高了畢業(yè)論文的質(zhì)量。

近年來，普通高等學(xué)校要有一定數(shù)量的綜合性、設(shè)計性實驗是教育部《普通高等學(xué)校本科教學(xué)工作評估方案》提出的要求，綜合設(shè)計實驗以研究性和設(shè)計實驗為主，可分為綜合實驗和設(shè)計實驗。設(shè)計實驗根據(jù)課程要求給出命題，讓學(xué)生從查閱資、設(shè)計和實施實驗方案、分析及表征實驗結(jié)果來培養(yǎng)學(xué)生正確設(shè)計實驗，獨立思考和獨立開展化學(xué)實驗的能力，以提高學(xué)生的思維能力、解決問題的能力和創(chuàng)新意識。為此，我們從2014年針對大三學(xué)生開設(shè)化學(xué)綜合設(shè)計實驗課程，并依托大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)平臺改進實驗教學(xué)內(nèi)容及方案，實驗中涉及的知識面廣 ，融合了無機合成、有機合成及其分析化學(xué)中的定性定量分析、光譜分析、化學(xué)分析及樣品處理等多方面的知識，有效地提高了學(xué)生綜合素質(zhì)和創(chuàng)新能力。