微生物膜應(yīng)用于水中尸體PMI推斷的前景展望

（中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)系，湖南 長沙 410013）

死亡時間（postmortem interval，PMI）是指受害者死亡至尸體被發(fā)現(xiàn)所經(jīng)歷的時間間隔[1]。在法醫(yī)學(xué)中，PMI對于死亡事件的重建十分重要[2-3]。尸體的分解是一個依賴于非生物因素（溫度、濕度）、生物因素（昆蟲、微生物、脊椎動物的清除活動）以及個體內(nèi)在特性的動態(tài)過程[4]。有研究結(jié)果[5]表明，生物因素在尸體腐敗過程中起著極其重要的作用，并存在一定的時序性變化規(guī)律。在陸地上尸體分解過程中，WOLFF等[6]觀察其變化并將腐敗劃分為新鮮期、腫脹期、腐敗期、腐敗進(jìn)展期以及干化期5個階段。而在水中，尸體分解過程與陸地差異較大，可分為沉沒新鮮期、漂浮早期、漂浮腐敗早期、漂浮腐敗進(jìn)展期以及沉沒遺骸期5個階段[7]。根據(jù)尸體是否漂浮于水面，將PMI分為尸體漂浮時間（postmortem floating interval，PMFI）和尸體水下時間（postmortem submersion interval，PMSI）。PMSI是指尸體進(jìn)入水中（完全或部分沉沒在水中）直到被發(fā)現(xiàn)的時間[8]。在實(shí)際案例中，水中尸體通常上浮后才被發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過長時間的浸泡，尸體高度腐敗，并且因水體環(huán)境對尸體的影響，早期尸體現(xiàn)象不明顯，使PMI的推斷變得更加困難。水中尸體的腐敗是個極為復(fù)雜的過程，是多種腐生菌與藻類相互作用的結(jié)果[9-11]。

1978年，COSTERTON提出了微生物膜（microbial biofilm）這一概念[12-13]。微生物膜是指微生物在生長過程中附著于非生物或生物表面，由自身產(chǎn)生的胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）（主要為胞外多糖、蛋白和胞外DNA）及其基質(zhì)網(wǎng)包裹的具有三維結(jié)構(gòu)的微生物群體[14-15]。微生物膜在自然界中普遍存在，自然水體中生物膜根據(jù)微生物膜附著的基底類型可分為石生生物膜、植物生物膜以及腐生生物膜[16]。附著在尸體表面的微生物膜屬于腐生生物膜，其中包含的微生物主要為異養(yǎng)微生物[16]，以尸體組織為營養(yǎng)。隨著時間的推移，這類微生物將不斷消耗營養(yǎng)基質(zhì)，而營養(yǎng)基質(zhì)的減少又使群落中的微生物組成發(fā)生改變[17]，即群落演替過程。因此，微生物膜的群落演替與水中尸體PMI密切相關(guān)[18]。近年來，通過微生物膜推斷PMI的研究日益增多，展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。本文對目前研究進(jìn)行總結(jié)，歸納微生物膜在水中尸體PMI推斷中的應(yīng)用及其影響因素，并分析其應(yīng)用的可行性、局限性等問題。

1 微生物膜概述

1.1 微生物膜

1674年，Antonie van Leeuwenhoek通過顯微鏡從牙菌斑中觀察到微生物，由此打開了微生物研究的大門[19]。此后，科學(xué)家對微生物進(jìn)行了大量研究，研究方法主要針對單一菌種，因此人們對于細(xì)菌的認(rèn)識也就僅限于單個菌種的特點(diǎn)。但是，微生物在自然界中無處不在，且98%的細(xì)菌均以群體的方式存在[14]。1972年，BAYSTON和PENNY觀察到在霍爾特分流導(dǎo)管表面有多層細(xì)菌分布并形成膜狀復(fù)合物。自1978年，COSTERTON在由呼吸機(jī)導(dǎo)管污染的細(xì)菌引發(fā)肺炎的研究中提出微生物膜的概念以來[12-13]，這一概念逐漸在國際各個領(lǐng)域得到認(rèn)可。目前，微生物膜不僅應(yīng)用于醫(yī)學(xué)，在環(huán)境保護(hù)、食品、畜牧業(yè)等領(lǐng)域均有相關(guān)研究，并在某些領(lǐng)域發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[10]。在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，BENBOW等[20]運(yùn)用水中尸體表面微生物膜進(jìn)行PMI推斷的研究。

微生物膜的形成主要經(jīng)歷黏附期、發(fā)展期和成熟期3個階段[21]。微生物通過自身的鞭毛、纖毛等依附在固體基質(zhì)上，隨后通過自身產(chǎn)生少量的EPS，更緊密地與基質(zhì)結(jié)合，隨著黏附微生物的增加，EPS也隨之增加，并逐漸形成一層水凝膠狀物覆蓋在微生物表面[22]，成為成熟穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)[23]。在自然環(huán)境的作用下，有部分細(xì)胞從微生物膜中游離出來，吸附新的固體基質(zhì)，并發(fā)生群落演替。

1.2 自然水體中微生物膜的分類

微生物膜的構(gòu)成主要是固體基質(zhì)、微生物以及胞外聚合物。在自然水體環(huán)境中（如江河、湖泊、池塘、溪流、沼澤、海洋等），根據(jù)其基質(zhì)的不同，可以將其主要分為石生生物膜（epilithic）、植物生物膜（epixylic）[24]以及腐生生物膜（epinecrotic）[16]。石生生物膜主要附著在水體環(huán)境中的巖石等非有機(jī)物上，以自養(yǎng)的藻類為主，受光照條件影響較大。楊帆[25]對長春南湖中的微生物膜進(jìn)行培養(yǎng)及研究，發(fā)現(xiàn)這類石生生物膜上藻類為優(yōu)勢種群，初期主要以硅藻為主，隨后綠藻成為優(yōu)勢種群。另外，不同季節(jié)的微生物膜也有差異，夏季微生物種類會更為豐富，生物量更大。附著于植物表面的微生物膜稱為植物生物膜，主要存在于水體環(huán)境中的落葉、樹干或其他植物腐殖質(zhì)上，有研究[26]顯示，其微生物群落以細(xì)菌為主。HEMPEL等[27]對淡水和海水中不同植物以及同一植物不同部位上的微生物膜進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同流域以及同一植物不同部位上微生物膜有顯著差異，而不同植物品種之間無顯著差異。另外，植物生物膜的主要組成部分是α變形桿菌和海洋浮游細(xì)菌。與石生生物膜不一樣的是，植物與微生物之間存在相互作用。植物中的有機(jī)成分可影響各種微生物的定植，反之，微生物膜中的微生物也會產(chǎn)生一些有利于植物生長或不利于其生長的化合物[28]。腐生生物膜是指附著在腐敗生物上的微生物群落，在先前鮭魚[29]、水禽[30]、老鼠[31]以及豬[16]尸體的研究中均有發(fā)現(xiàn)。腐生生物膜中的微生物與植物生物膜類似，異養(yǎng)型微生物在群落中起著重要的作用。

1.3 微生物膜的研究技術(shù)

微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性研究技術(shù)多種多樣，包括傳統(tǒng)培養(yǎng)分離法、群落水平生理學(xué)指紋法（community level physiological profiles，CLPP）、生物標(biāo)記法以及現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)[32]。傳統(tǒng)培養(yǎng)分離法主要是將樣品置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對其菌落進(jìn)行計數(shù)并在顯微鏡下觀察形態(tài)，根據(jù)其理化性質(zhì)進(jìn)行分類，但這類方法不能用于觀察群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化。1991年，Garland和Mills提出一種酶分析方法即CLPP[33]。CLPP是一種基于微生物對不同碳源的利用能力來反映種群組成的方法，該方法檢測簡便且快速，因此得以廣泛應(yīng)用。Biology-Ecoplate是一種96孔微平板，31孔內(nèi)含有培養(yǎng)基、氧化還原染料以及不同碳源，第32個孔為無碳源的對照孔，重復(fù)3次[34]，通過觀察微生物與氧化還原染料的反應(yīng)，對其進(jìn)行檢測及分析。然而，該技術(shù)所檢測的對象有其局限性，僅適用于快速生長的微生物。另外，平板中加入的氧化還原染料四氮唑具有一定的生物毒性，可能影響檢測結(jié)果。生物標(biāo)記法是指對微生物中的生物標(biāo)記物進(jìn)行提取、純化以及測定，來評估微生物群落結(jié)構(gòu)。目前常用的有醌指紋法（quinones profiling）和脂肪酸譜圖法，后者包括磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA）和脂肪酸甲酯（fatty acid methyl ester，F(xiàn)AME）。

現(xiàn)代分子生物技術(shù)，如聚合酶鏈反應(yīng)變性凝膠梯度電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)、限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）等是現(xiàn)階段能夠較為精確分析微生物種群分布的技術(shù)[35]。目前，現(xiàn)代分子生物技術(shù)均是基于對16S RNA的檢測分析。16S RNA是原核生物核糖體小亞基上的RNA，片段長度約1500bp。該RNA基因幾乎存在于所有的細(xì)菌中，除了具有高度保守性之外，還存在可變區(qū)提供潛在的位點(diǎn)分析區(qū)域。DGGE可區(qū)分長度相同但序列不同的DNA片段，其原理是將擴(kuò)增后等長DNA片段在含有DNA變性劑的聚丙烯酰胺凝膠中電泳，序列不同的DNA在不同的變性濃度中解鏈變性、改變結(jié)構(gòu)，從而影響其電泳的速度，在凝膠的不同位置停止[36]。該方法的優(yōu)勢在于重復(fù)性好，可同時檢測大量樣品，但DGGE受DNA提取效果影響較大，還受PCR擴(kuò)增偏差的影響[37]。RFLP技術(shù)分為以rDNA為擴(kuò)增對象的核糖體DNA擴(kuò)增片段限制性分析（amplified ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA）以及用熒光標(biāo)記引物的末端限制性片段長度多態(tài)性（terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）。該技術(shù)是利用某種限制性內(nèi)切酶識別DNA片段上的特殊序列并進(jìn)行切割，使DNA鏈被分割成長度不同的片段，經(jīng)電泳后不同長度的片段停在不同的位置[32]，再將所得的結(jié)果與已知微生物DNA序列文庫進(jìn)行比對，確定種屬。RFLP是一種自動化且高通量的測序技術(shù)，能夠比較微生物群落結(jié)構(gòu)間的差異。但其與DGGE類似，同樣受DNA提取效果影響，也受PCR擴(kuò)增偏差的影響[37]。而微生物膜中除了菌類之外，還包含各種藻類。對于藻類多樣性及群落結(jié)構(gòu)分布的研究技術(shù)主要是高通量測序，通過識別內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）、18S rRNA、28S rRNA、葉綠體rbcL和線粒體cob等進(jìn)行物種鑒定[11，38-40]。高通量測序是指同時對幾百萬到十億條DNA分子進(jìn)行測序，又稱為下一代測序技術(shù)[41]。該技術(shù)可以在數(shù)百萬個點(diǎn)上同時檢測，因此該技術(shù)具有測序速度快、通量高的優(yōu)點(diǎn)。但是，高通量測序技術(shù)的局限性是不容忽視的，其局限性在于后續(xù)數(shù)據(jù)分析工作量很大。另外，費(fèi)用較高也限制了其廣泛應(yīng)用。

2 微生物膜的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景

2.1 微生物膜在水中尸體的研究

寄生于尸體上的微生物多屬于異養(yǎng)生物，主要以尸體組織為營養(yǎng)，隨著營養(yǎng)物質(zhì)的減少，群落中的微生物種類也會發(fā)生相應(yīng)的變化。死后尸體表面的微生物膜群落是存在演替規(guī)律的，因此，微生物膜可為PMI推斷提供依據(jù)[22]。目前，有學(xué)者通過高通量宏基因組測序技術(shù)對陸地環(huán)境中的人、豬、小鼠等尸體群落演替過程進(jìn)行研究，觀察不同時間段出現(xiàn)在尸體上的群落，用以推斷晚期 PMI[2，23]。

但是，微生物在陸地尸體上的群落演替過程會受到一些因素的影響而具有不確定性，如嗜尸性昆蟲的出入影響尸體微生物的分布[3，42]。在水生環(huán)境中，微生物主要在微生物膜中富集，而漂浮于水中的密度較低[16]。因此，微生物膜的微生物群落演替及相對豐度變化是一種潛在的推斷水中尸體PMI的方法[16]。

BENBOW等[20]通過高通量宏基因組測序技術(shù)對不同季節(jié)（夏季和冬季）水中尸體表面的微生物膜進(jìn)行研究，結(jié)果表明，在尸體的腐敗過程中，微生物膜中微生物相對豐度有顯著變化，并且不同季節(jié)微生物組成也有差異。多項研究結(jié)果[16，20，43]顯示，夏季和冬季的水中尸體上，變形菌門和厚壁菌門均為微生物膜中主要的菌門，且變形菌門相對豐度隨時間推移不斷下降，而厚壁菌門相對豐度不斷上升，說明細(xì)菌相對豐度與PMI存在相關(guān)性，可通過檢測某一種類微生物的相對豐度在演替過程中的動態(tài)變化來推斷相應(yīng)的PMI，但這種相關(guān)性仍需進(jìn)一步探究。

另外，在具體的細(xì)菌種屬水平，DICKSON等[43]通過對海水中豬尸體頭部的研究，發(fā)現(xiàn)在某個特定時間點(diǎn)會出現(xiàn)某種細(xì)菌。如秋天肉食桿菌屬僅在第七天取樣時被檢測到，這說明微生物種類演替規(guī)律存在推斷PMI的潛在價值。

2.2 微生物膜應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)中的優(yōu)勢

將微生物膜應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)中的優(yōu)勢主要在于：（1）微生物膜中微生物以尸體為營養(yǎng)物質(zhì)，其種類和豐度會隨尸體的理化性質(zhì)改變而改變，與PMI有著密切聯(lián)系。（2）微生物普遍存在于環(huán)境中，用微生物膜進(jìn)行推斷PMI易于操作，取材簡便。（3）將微生物膜的微生物群落作為PMI的推斷工具比研究單一的微生物更為科學(xué)。某種微生物的出現(xiàn)或消失并非只受尸體變化的影響，同時受到其他微生物的作用。若根據(jù)單一的微生物來推斷PMI，誤差較大，而微生物膜是研究一個微生物群體在尸體上的改變，即演替規(guī)律。演替在生態(tài)學(xué)中是指群落或者生態(tài)系統(tǒng)沿著一定的方向發(fā)生有規(guī)律、可預(yù)測的變化。并且群落演替是一個連續(xù)發(fā)生的穩(wěn)健過程[16]，這使得PMI的推斷更為準(zhǔn)確。（4）微生物膜是一種有胞外聚合物包裹的三維結(jié)構(gòu)的微生物群體，這層胞外聚合物穩(wěn)定存在，能夠有效阻擋環(huán)境變化帶來的影響。這一特點(diǎn)能夠保障在推斷PMI時，盡量將其他因素的影響降到最低。

3 微生物膜應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)的影響因素

3.1 溫度

尸體周圍的各種環(huán)境因素都能影響尸體內(nèi)、外細(xì)菌群落多樣性，從而影響尸體腐解的整個過程[4]。在陸地尸體中，環(huán)境溫度對尸體的腐解過程影響最大。多項研究均在夏季或者冬季進(jìn)行，結(jié)果顯示，在相同的PMI細(xì)菌的相對豐度會有所差異。在溫度高的環(huán)境中，尸體分解速度更快。BENBOW等[20]研究發(fā)現(xiàn)在夏季尸體完全分解需要21d左右，但在冬季需要42d左右。因此，高溫環(huán)境中尸體進(jìn)入腐敗階段比低溫環(huán)境中更快，微生物膜中微生物群落演替會在死后發(fā)生較早。在實(shí)際PMI推斷中，需考慮環(huán)境溫度因素，根據(jù)相應(yīng)的模型進(jìn)行推斷。

3.2 水體理化因素

不同水體的理化性質(zhì)會影響水中尸體微生物種類[44]。水質(zhì)的參考因素主要包括溶氧度、pH值、電導(dǎo)率、水溫、總固體溶解度、氧化還原電位和鹽度等。LANG等[16]利用核糖體間隔基因分析技術(shù)對兩個不同水域的家豬尸體微生物膜進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其演替受水體環(huán)境的影響。當(dāng)不同水域的理化因素明顯不同時，附著在尸體表面的微生物膜的組成也會有所差異。由此可見，水體的理化性質(zhì)在微生物膜形成過程中發(fā)揮著自然選擇的作用，根據(jù)適者生存的原則，微生物的種類有著明顯差異。如海水中的含鹽量比較高，存在于陸地動物體表的微生物在高鹽高滲透壓的環(huán)境中會迅速死亡[8]。在很短的時間內(nèi)，微生物膜的組成就會由陸地微生物為主轉(zhuǎn)變?yōu)楹Ｋ械哪望}微生物為主，這使海水中尸體微生物膜的演替與淡水存在極大的差別。

3.3 昆蟲

在影響微生物的分布的因素中，嗜尸性昆蟲也起著至關(guān)重要的作用。陸地環(huán)境中，隨著腐敗不斷發(fā)展，尸體被微生物不斷分解，腐敗尸體釋放出揮發(fā)性化合物（volatile compound，VOC），吸引各種昆蟲或者節(jié)肢動物在尸體取食、產(chǎn)卵并繁殖[45]。然而，在尸體上這些昆蟲幼蟲的生長發(fā)育可通過直接或間接的競爭破壞已建立的微生物群落[46]。如絲光綠蠅在消耗尸體組織的同時會產(chǎn)生某種分泌物，影響微生物種類的演替，這種改變在麗蠅的清創(chuàng)治療案例中得到證明[47-48]。昆蟲在到達(dá)尸體前自身攜帶多種微生物，如家蠅攜帶有100多種致病菌[49-50]，這些微生物可成為尸體上的外源性微生物群落，并影響尸體上本來的微生物群落分布。水體環(huán)境中，水生昆蟲雖不能直接取食尸體，但仍可以尸體為基質(zhì)或棲息場所。尸體漂浮時，嗜尸性蠅類也有可能在暴露于水面上的尸體部位產(chǎn)卵、繁殖等[51]。因此，陸地環(huán)境中昆蟲對微生物的影響同樣適用于水中環(huán)境。

3.4 藻-菌共生演替

在水中環(huán)境，藻類與菌類的關(guān)系表現(xiàn)為復(fù)雜的共生、協(xié)同、競爭關(guān)系。菌類通過分解水體環(huán)境中的物質(zhì)產(chǎn)生某些物質(zhì)，抑制或者促進(jìn)藻類的生長，同時，藻類也會通過光合作用釋放有機(jī)質(zhì)提供給異養(yǎng)菌群，這種循環(huán)體系稱為“藻-菌”共生演替現(xiàn)象[52]。根據(jù)菌類產(chǎn)生的物質(zhì)對藻類的作用，可將其分為促生菌和抑生菌。不論是促生菌還是抑生菌都會改變同一環(huán)境下的藻類行為，MITSUTANI等[53]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，假單胞菌能夠分泌一種活性酶抑制藻類的生長。另外，有研究[54]證實(shí)，與藻類相關(guān)的菌類均為特定的菌群。因此，當(dāng)菌群種類發(fā)生改變時，藻類也會通過營養(yǎng)依賴或者信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等作用[54]隨之發(fā)生變化，反之亦然。在水中尸體微生物膜中，同樣存在這種藻-菌共生演替現(xiàn)象。在微生物膜的研究中，不能僅限于菌群的演替，還需要對藻菌共生演替進(jìn)行研究。

3.5 其他

除上述因素外，取材部位也是一個不容忽視的影響因素。有研究[43]分析豬尸體頭部細(xì)菌群落演替發(fā)現(xiàn)，雖然大多微生物種類普遍存在于各種組織，但在臉頰（普通皮膚）、口鼻處（溫暖濕潤的隱蔽部位皮膚）和傷口處（大量肌肉組織和脂肪組織暴露的地方）獲取的部分微生物的種類會有所差異。因此，取樣時應(yīng)注意不同部位微生物膜存在差異，可在PMI推斷過程中造成影響。死亡原因也是影響尸體上微生物群落分布的一個重要因素，在今后的研究中值得探討。另外，死者的衣著狀態(tài)（或尸體表面是否存在包裹物）、河岸土地的使用情況以及水體流速等都可以直接影響尸體表面的微生物膜菌群，繼而可能影響其在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。在目前研究中，尚未深入探討這些影響因素，但這些因素是實(shí)際工作中不可避免的，也是推斷PMI必須綜合考慮的。

微生物膜作為微生物的重要存在形式，廣泛分布于人體、醫(yī)療設(shè)備和水體中，與尸體的腐敗和死亡時間密切相關(guān)。近年來，微生物膜在法醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用，尤其在PMI推斷方面的研究日益增加，宏基因組測序等技術(shù)的發(fā)展和普及也為微生物膜的研究提供了支持。但是，應(yīng)用微生物膜推斷PMI缺少足夠的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和統(tǒng)一的數(shù)學(xué)模型。如何將不同的影響因素進(jìn)行歸納總結(jié)，并在影響因素相同或相似的情況下，探究合適的推斷方法也將成為進(jìn)一步研究的方向之一。當(dāng)然，每一種PMI推斷方法都有其局限性，不可能做到絕對的精確，微生物膜也不例外。在未來的研究中，可將微生物膜與生態(tài)學(xué)結(jié)合運(yùn)用，使PMI推斷更為準(zhǔn)確。