藏豬腹瀉物中細(xì)菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

彭青，李榮麗，湯佩琦，葉兵兵

（四川民族學(xué)院農(nóng)學(xué)院，四川 康定 626001）

藏豬是世界上少有的高原型豬種，是我國(guó)寶貴的地方品種資源，主要分布于四川、甘肅、云南、西藏、青海等高寒地區(qū)[1]。藏豬生活在高海拔地區(qū)，能夠適應(yīng)惡劣的氣候環(huán)境，具有耐寒冷、抗病能力強(qiáng)、耐粗飼等特點(diǎn)，其肉質(zhì)鮮美，具有很好的市場(chǎng)前景。隨著藏豬人工養(yǎng)殖的擴(kuò)大，一些細(xì)菌性疾病越來(lái)越突出，腹瀉就是影響藏豬生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素之一。本文筆者及其團(tuán)隊(duì)對(duì)甘孜州畜科所及當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶飼養(yǎng)的藏豬腹瀉物進(jìn)行了細(xì)菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)，為藏豬腹瀉的有效防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料采集 在甘孜州康定地區(qū)藏豬保種場(chǎng)及當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶無(wú)菌采集藏豬腹瀉物樣本30份。

1.2 試劑 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基、瓊脂糖、革蘭氏染劑、細(xì)菌DNA試劑提取盒、27F和14R上下游引物、Mix、ddH2O、藥敏試劑片等，均購(gòu)自成都某生物科技有限公司。

1.3 儀器 恒溫培養(yǎng)箱、恒溫振蕩箱、臺(tái)式離心機(jī)、PCR基因擴(kuò)增儀、電泳儀、光學(xué)顯微鏡等。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)菌分離 在超凈工作臺(tái)上，將采集來(lái)的腹瀉病料接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在37℃恒溫振蕩箱中增菌培養(yǎng)18～24h；用平板劃線法將擴(kuò)增菌液分別接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，并編號(hào)；接種完成后將培養(yǎng)基置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h；根據(jù)菌落形態(tài)及顏色特點(diǎn)分離純化培養(yǎng)24h。

1.4.2 鏡檢 挑取分離純化的單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。

1.4.3 細(xì)菌DNA模板制備 將純化后的細(xì)菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在37℃恒溫振蕩箱中培養(yǎng)18～24h，將培養(yǎng)得到的菌液用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取細(xì)菌的DNA。

1.4.4 PCR 擴(kuò)增 取 ddH2O 3.2 μL，Mix 5 μL，27F和14R上下游引物各0.4μL，細(xì)菌DNA 1μL，共10μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性 50 s、56℃退火 45 s、72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。取反應(yīng)產(chǎn)物1μL用瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)EB染色后置于紫外燈下觀察并拍照。

1.4.5 藥敏試驗(yàn) 將分離得到的混合菌株采用K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)：用無(wú)菌鑷子依次將藥敏試劑片貼于MH瓊脂培養(yǎng)基上，并做好標(biāo)記；然后放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈的直徑[2]。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌生長(zhǎng)情況 在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上普遍存在兩種菌落，分別是紅色或粉紅色、圓形、表面光滑的菌落和透明或半透明的圓形菌落。如圖1所示。

2.2 鏡檢結(jié)果 在10×100倍油鏡下觀察可見(jiàn)兩端鈍圓的革蘭氏陰性短小桿菌，有的呈多種形態(tài)，散在或成對(duì)排列（見(jiàn)圖2），可初步鑒定為大腸桿菌和變形桿菌[3]。

2.3 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 見(jiàn)圖3。

圖1 細(xì)菌生長(zhǎng)情況

圖2 鏡檢結(jié)果

圖3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

表1 混合菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 由表1可知，混合菌對(duì)頭孢曲松極度敏感，對(duì)丁胺卡那霉素高度敏感，對(duì)恩諾沙星、新霉素、氟苯尼考、慶大霉素、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素低度敏感，對(duì)復(fù)方新諾明、鏈霉素、氨芐西林、青霉素有耐藥。

3 小結(jié)

3.1 本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)藏豬腹瀉物進(jìn)行細(xì)菌分離、培養(yǎng)、鏡檢、PCR測(cè)序，得到腹瀉物中的細(xì)菌主要是大腸桿菌和變形桿菌。

3.2 藥敏試驗(yàn)表明，混合菌對(duì)頭孢曲松極度敏感，對(duì)丁胺卡那霉素高度敏感，對(duì)恩諾沙星、新霉素、氟苯尼考、慶大霉素、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素低度敏感，對(duì)復(fù)方新諾明、鏈霉素、氨芐西林、青霉素有耐藥。故在臨床防治時(shí)應(yīng)避免使用復(fù)方新諾明、鏈霉素、氨芐西林、青霉素這類的抗生素，適當(dāng)性使用頭孢曲松、丁胺卡那霉素，并且交替使用不同的抗生素以免耐藥。

3.3 由于試驗(yàn)時(shí)間、空間等的限制，本次采集的樣本較少，不能代表本地區(qū)的所有情況，若要說(shuō)明本地區(qū)的整體情況，還需采集更多的樣本進(jìn)行進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)結(jié)果僅供參考，不可作為臨床用藥的依據(jù)。