咸干藍(lán)點(diǎn)馬鮫品質(zhì)特征與優(yōu)勢(shì)菌群分析*

王睿迪 劉勝男 王 玉 趙延寧 薛 勇

(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 食品科學(xué)與人類健康實(shí)驗(yàn)室 青島 266003)

藍(lán)點(diǎn)馬鮫(Scomberomorus niphonius)，俗稱鲅魚，具有魚刺少、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，是北方沿海地區(qū)常見的食用魚類。咸干鲅魚是以鮮(凍)鲅魚肉為主要原料，采用食鹽腌制和干燥工藝加工而成的典型咸干魚制品，也是我國(guó)沿海地區(qū)最具代表性的傳統(tǒng)水產(chǎn)制品。咸干鲅魚具有風(fēng)味獨(dú)特、易于貯藏的特點(diǎn)，但目前加工方式仍以手工作坊式加工和自然晾曬為主，產(chǎn)品存在含鹽量高、風(fēng)味不穩(wěn)定等問(wèn)題。目前我國(guó)對(duì)傳統(tǒng)咸干魚制品的研究還缺乏系統(tǒng)性，尤其是針對(duì)咸干鲅魚的研究還非常少。

為了了解市售咸干鲅魚產(chǎn)品的品質(zhì)情況，本研究采集了7種不同產(chǎn)地的咸干鲅魚產(chǎn)品，通過(guò)感官評(píng)價(jià)篩選出青島產(chǎn)一鹵鮮咸干鲅魚作為代表性研究對(duì)象，對(duì)品質(zhì)相關(guān)的理化指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)分析。另外，由于優(yōu)勢(shì)菌對(duì)干腌水產(chǎn)品發(fā)酵過(guò)程及風(fēng)味的形成具有重要的作用(吳海燕等，2010)，本研究還對(duì)咸干鲅魚中的優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行了分離純化和種類鑒定，并對(duì)菌株的基本生理生化性質(zhì)進(jìn)行了研究，以期為咸干鲅魚的現(xiàn)代化加工和質(zhì)量控制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從煙臺(tái)、威海、青島、日照、連云港、溫州、 大連7個(gè)地區(qū)分別采集咸干鲅魚樣品，分別編號(hào)為1～7。樣品體長(zhǎng)為25～30 cm，質(zhì)量為250～300 g。

Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(生工生物工程上海股份有限公司)；組胺測(cè)定試劑盒(Kikkoman公司，日本)；革蘭氏染色試劑盒(日水制藥公司，日本)。

MRS培養(yǎng)基、MRS肉湯、RBA培養(yǎng)基、PCA培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)；AgNO3、K2CrO4、三氯乙酸、MgO、硫代巴比妥酸、三氯甲烷、FeCl2、K4Fe(CN)6·3H2O、乙酸鋅、對(duì)氨基苯磺酸、溴甲酚紫均為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；甲醇為色譜純(天津博迪化工股份有限公司)。

1.2 主要儀器

Kjeltec 8400型全自動(dòng)凱氏定氮儀(FOSS有限公司，瑞士)；7200型可見分光光度計(jì)(UNIC公司， 德國(guó))；IKA-TI8型高速分散機(jī)(IKA有限公司，德國(guó))；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；Fluo ViewTMFV1000型激光共聚焦顯微鏡(Olympus公司，日本)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 感官評(píng)價(jià) 將7份樣品分別清洗干凈并浸泡脫鹽后，在蒸鍋上蒸15 min。由15名經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的感官評(píng)價(jià)人員按照表1綜合組織狀態(tài)、色澤、氣味、滋味、咀嚼度5個(gè)方面進(jìn)行評(píng)分。

1.3.2 理化指標(biāo)測(cè)定方法 參照GB 5009.44-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氯化物的測(cè)定》(2016)，采用銀量法測(cè)定NaCl含量；參照GB 5009.3-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》(2016)，采用直接干燥法測(cè)定水分含量；參照GB 5009.33-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》(2016)，采用分光光度法測(cè)定NaNO2含量；參照GB 5009.228- 2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》(2016)，采用自動(dòng)凱氏定氮儀法測(cè)定TVB-N含量。

表1 咸干魚感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) Tab.1 Sensory evaluation standard for dried salted S.niphonius

TBARS值的測(cè)定參照劉昌華(2012)的方法，并略作修改。取5 g魚肉切碎，加10% TCA 溶液45 ml，勻漿后靜置1 h，2000 r/min離心10 min，過(guò)濾，用H2O2定容至50 ml。取2 ml濾液加0.02 mol/L的TBA溶液2 ml，在沸水浴中反應(yīng)20 min，冷卻后用分光光度計(jì)測(cè)定532 nm處的吸光值。

1.3.3 微生物計(jì)數(shù)與分離純化 參照賀林娟(2013)的方法，并略作修改。無(wú)菌條件下取咸干魚樣品25 g，剪碎后加入裝有225 ml無(wú)菌生理鹽水和玻璃珠的錐形瓶中，振搖充分得到樣品原液。用無(wú)菌生理鹽水將樣品原液按1：10的比例進(jìn)行梯度稀釋。采用平板涂布法，將各稀釋液分別接種于PCA、MRS和RBA固體培養(yǎng)基中，分別按照 GB 4789.2-2016(2016)、 GB 4789.35- 2016(2016)、GB 4789.15-2016(2016)進(jìn)行菌落總數(shù)、乳酸菌菌落數(shù)、霉菌及酵母菌菌落數(shù)測(cè)定。

從PCA、MRS和RBA平板上挑取優(yōu)勢(shì)菌落于相應(yīng)分離培養(yǎng)基上劃線分離，30℃培養(yǎng)48 h，重復(fù) 2～3次獲得純的單菌落。

1.3.4 生理生化實(shí)驗(yàn) 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》(東秀珠等,2001)、《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》(凌代文等,1999)以及相關(guān)文獻(xiàn)(盧曉莉,2007; 朱雯娟,2015)對(duì)純化的菌株進(jìn)行革蘭氏染色、過(guò)氧化氫酶、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、耐鹽性等生理生化實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 優(yōu)勢(shì)菌株的種類鑒定 將純化后的菌株接種于相應(yīng)的種子培養(yǎng)基，30℃條件下200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，離心收集菌體，采用DNA抽提試劑盒提取DNA。將提取出的DNA樣品交由生工生物工程上海股份有限公司進(jìn)行后續(xù)的PCR擴(kuò)增及16S rDNA測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源性檢索和比對(duì)分析，從GenBank中調(diào)取與其同源性較高的相似序列，使用MEGA 7.0進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果用鄰接法(Neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過(guò)自舉分析檢測(cè)置信度(1000次重復(fù))(姚學(xué)良等，2015)。

2 結(jié)果與分析

2.1 咸干鲅魚感官評(píng)價(jià)結(jié)果

不同產(chǎn)地咸干鲅魚產(chǎn)品的感官評(píng)價(jià)結(jié)果如圖1所示。從氣味方面來(lái)看，1、3號(hào)樣品清香純正，有咸干魚特有風(fēng)味，2、4號(hào)氣味稍淡，7號(hào)氧化味重。在口感方面，3號(hào)樣品咸淡適中，評(píng)分最高，其他樣品均偏咸，得分較低，且差別不大。另外，3號(hào)樣品組織狀態(tài)、咀嚼度兩項(xiàng)指標(biāo)對(duì)應(yīng)的評(píng)分也較高。因此，選擇3號(hào)樣品即青島產(chǎn)咸干鲅魚作為后續(xù)研究的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

圖1 不同產(chǎn)地咸干鲅魚感官評(píng)價(jià)結(jié)果 Fig.1 Sensory scores of seven dried salted S.niphonius

2.2 咸干鲅魚理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

青島一鹵鮮咸干鲅魚理化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果如表2所示。樣品水分含量為54.4%，屬于半干水產(chǎn)品。GB/T 30894-2014《咸魚》(2014)中規(guī)定NaCl含量應(yīng)在3%～11%的范圍內(nèi)，檢測(cè)樣品的NaCl含量為3.10%，屬于低鹽咸魚。NaNO2含量為5.07 mg/kg，大幅低于GB 2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》(2014)中所規(guī)定的腌臘肉制品中NaNO2(以NaNO2或KNO2計(jì))≤30 mg/kg的限量要求，因此傳統(tǒng)咸干鲅魚NaNO2超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較小。TVB-N是指動(dòng)物性食品由于酶和微生物的作用使蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生的氨以及胺類等堿性含氮物質(zhì)，常用來(lái)表征樣品的新鮮度。樣品中TVB-N含量高達(dá)40.12 mg/100 g，而GB 2733-2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品》(2015)中規(guī)定鮮、凍海水魚中的TVB-N含量不應(yīng)超過(guò)30 mg/100 g，這說(shuō)明咸干鲅魚產(chǎn)品相較于鮮、凍鲅魚原料蛋白質(zhì)降解程度較大，而這可能與發(fā)酵過(guò)程有關(guān)。脂肪氧化酸敗是凍藏過(guò)程中水產(chǎn)品發(fā)生品質(zhì)劣變的主要原因之一，利用硫代巴比妥酸與丙二醛反應(yīng)生成粉紅色物質(zhì)測(cè)定TBARS值，可以準(zhǔn)確反映脂質(zhì)氧化程度(曹榮等,2016)。Ersoy等(2008)認(rèn)為鮮、凍水產(chǎn)品的TBARS值≤8.0 mg/kg時(shí)適宜人類食用，咸干鲅魚的TBARS值為10.0 mg/kg，略高于8.0 mg/kg的推薦標(biāo)準(zhǔn)，這與樣品水分含量低有關(guān)，且尚未對(duì)產(chǎn)品的感官品質(zhì)造成明顯影響。

表2 咸干鲅魚的基本理化指標(biāo) Tab.2 The basic physicochemical properties of dried salted S.niphonius

2.3 咸干鲅魚菌落計(jì)數(shù)結(jié)果

由各計(jì)數(shù)平板得知咸干魚樣品中菌落總數(shù)為1.68×105CFU/g，乳酸菌菌落數(shù)為1.06×105CFU/g，霉菌及酵母菌落數(shù)為4.7×104CFU/g。腌干魚樣品中的微生物以細(xì)菌菌相為主，霉菌及酵母菌相對(duì)較少。咸干鲅魚的腌漬和干燥工藝使得產(chǎn)品滲透壓升高而水分活度降低，從而抑制了部分微生物的生長(zhǎng)。另外，咸干鲅魚產(chǎn)品多采用低溫保藏，微生物生長(zhǎng)也受到了一定的影響。

2.4 典型菌株的生理生化特性

咸干鲅魚的品質(zhì)形成過(guò)程主要是微生物發(fā)酵的結(jié)果。從計(jì)數(shù)平板上篩選到10株典型菌落，分別編號(hào)為X1～X10，其生理生化特征如表3所示。1955年芬蘭科學(xué)家Niinivaara提出理想的發(fā)酵菌株應(yīng)具有革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陽(yáng)性、快速產(chǎn)酸、不產(chǎn)氣、耐鹽性、不產(chǎn)生物胺以及能抑制大腸桿菌(Escherichia coli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等生理特征(Ijonget al,1996; 劉成江等,2009; 李鳳彩等,2002)。在所篩選到的10株菌中，X2、X4、X5、X9為革蘭氏陰性菌，其余6株為革蘭氏陽(yáng)性菌，該6株細(xì)菌均具有抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的活性(表4)，其中僅X1符合上述發(fā)酵微生物的標(biāo)準(zhǔn)。因此，綜合判斷菌株X1可能是咸干鲅魚發(fā)酵過(guò)程中的主導(dǎo)菌株。

表3 典型菌株的生理生化特征 Tab.3 The physiological and biochemical properties of dominant bacteria strains

表4 典型革蘭氏陽(yáng)性菌菌株的抑菌活性 Tab.4 The antibacterial activities of typical Gram-positive bacteria strains

2.5 優(yōu)勢(shì)菌株的種類鑒定結(jié)果

菌株X1、X2、X3、X4分別占菌落總數(shù)的21%、14%、11%、10%，在數(shù)量上占有優(yōu)勢(shì)。將菌株X1～X4的16S rDNA序列分別與GenBank中的已知序列進(jìn)行比對(duì)，并利用MEGA 7.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)果見圖2。

根據(jù)同源性分析，菌株X1與Lactobacillus sakeistrain YY1(KM267631.1)的遺傳距離最近，二者的同源性為100%，因此可以確定X1為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的清酒乳桿菌；菌株X2與X4為同一類群，屬于腸桿菌屬(Enterobacter)中的兩個(gè)種，X2和X4分別與產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、香坊腸桿菌(Enterobacter xiangfangensis)的親緣關(guān)系最為密切；菌株X3屬于短小芽孢桿菌屬(Lysinibacillus) 并與長(zhǎng)賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus macrolides)的親緣關(guān)系最近。

由此，咸干鲅魚中的優(yōu)勢(shì)菌株主要集中在乳桿菌科(Lactobacillaceae)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)以及芽孢桿菌科(Bacillaceae)。Huss等(1990)提出當(dāng)水分活度為0.98～0.93、鹽度為3.5～10時(shí)，食品及其原料中的優(yōu)勢(shì)微生物為乳酸桿菌科、腸桿菌科、芽孢桿菌科、小球菌科(Micrococcaceae)以及霉菌。而近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后對(duì)魚酢、臘魚等魚制品進(jìn)行菌相分析，結(jié)果均表明乳酸菌、微球菌、葡萄球菌為發(fā)酵優(yōu)勢(shì)菌群，影響著魚制品的風(fēng)味，并將篩選菌種成功應(yīng)用于魚制品，縮短生產(chǎn)周期(楊錫洪等,2009; Anihouviet al,2007)。曾令彬等(2007)的研究表明，臘魚制品腌制過(guò)程中微生物菌群與風(fēng)味物質(zhì)的形成密切相關(guān)，腌臘魚制品的優(yōu)勢(shì)菌為乳酸菌。Paludan-Müller等(2002)也提出乳酸菌是肉制品發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)微生物，并能促進(jìn)發(fā)酵魚肉類制品的風(fēng)味形成。Rantsiou等(2005)從自然發(fā)酵香腸中分離到358株乳酸菌，其中以彎曲乳桿菌(Lactobacillus crispatus)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)和清酒乳桿菌為主。Bonomo等(2008)從意大利南部的傳統(tǒng)發(fā)酵香腸中分離乳酸菌,其中清酒乳桿菌是優(yōu)勢(shì)菌(67%)，其次是戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)(16%)。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)論基本一致。

3 結(jié)論

咸干鲅魚屬于半干低鹽咸干魚制品，NaNO2含量在食品安全標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的范圍內(nèi)，樣品的TVB-N含量偏高，這可能與原料新鮮度以及發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)降解有關(guān)，TBARS值為10.00 mg/kg，脂質(zhì)氧化程度在感官可接受的范圍內(nèi)。咸干魚樣品中的微生物以細(xì)菌為主，清酒乳桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、長(zhǎng)賴氨酸芽孢桿菌和香坊腸桿菌比例相對(duì)較高。結(jié)合生理生化特征，清酒乳桿菌可能是傳統(tǒng)咸干鲅魚發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌株。

圖2 基于16S rDNA的優(yōu)勢(shì)菌株X1～X4基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.2 Phylogenetic tree of strain X1～X4 on the basis of 16S rDNA sequence