四個(gè)口蘑科真菌形態(tài)學(xué)及rDNA-ITS測(cè)序鑒定

田慧敏 王秀艷 尹元 呂曉娜 李曉東

摘要：利用形態(tài)學(xué)與rDNA-ITS序列分析相結(jié)合的方法對(duì)4個(gè)口蘑科真菌樣本（CFSZ10080、CFSZ10305、CFSZ11669、CFSZ10245）進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，CFSZ10080為黃褐口蘑[Tricholoma fulvum （DC.） Bigeard & H. Guill]，CFSZ10245為鱗柄口蘑[Tricholoma psammopus （Kalchbr.） Quél]，CFSZ11669為銀灰口蘑[Tricholoma argyraceum （Bull.） Gillet]，CFSZ10305為毛邊菇[Ripartites tricholoma （Alb. & Schwein.）P. Karst]，為內(nèi)蒙古新記錄種。4種口蘑科真菌均為優(yōu)質(zhì)食用菌。

關(guān)鍵詞：口蘑科;形態(tài)學(xué)鑒定;rNDA-ITS序列

中圖分類(lèi)號(hào)：Q939.5? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）02-0137-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.02.030? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

口蘑科（Tricholomataceae）隸屬擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycetes）傘菌目（Agaricales），該科真菌包括90余屬1 800多種[1]。但是根據(jù)近期分子生物學(xué)研究結(jié)果表明白蘑科包括7個(gè)屬Leucopaxillus、Tricholoma、Pseudotricholoma、Melanoleuc、Ripartites、Dennisiomyces和Corneriella等[2]。主要特征是子實(shí)體肉質(zhì)，菌蓋與菌柄組織連結(jié)，菌柄中生或偏生，菌褶彎生、直生，孢子印白色、淡黃色、粉紅色，但在顯微鏡下無(wú)色或近無(wú)色[3]。該科真菌為世界性分布種，有的生于林中地上，與樹(shù)木形成共生菌根，如松口蘑;有的生于蟻巢中，如白蟻傘;有的生于草地，如蒙古口蘑，可形成蘑菇圈。該科包括多種美味可食的蘑菇，如草原口蘑、松口蘑、蒙古口蘑、紫丁香蘑等。有多種口蘑科真菌具抗癌、抗病毒、降血壓等功能[4-6]。然而，也有的口蘑含毒素，如皂味口蘑（Tricholoma saponaceum）。口蘑科真菌種類(lèi)繁多，分類(lèi)復(fù)雜，傳統(tǒng)的形態(tài)特征分類(lèi)鑒定帶有一定的局限性和主觀性。近些年來(lái)rDNA-ITS測(cè)序法已大量用于對(duì)口蘑科真菌的菌種鑒定、系統(tǒng)發(fā)育及親緣關(guān)系分析中[7-11]。

本研究擬對(duì)赤峰地區(qū)4個(gè)口蘑科真菌利用形態(tài)學(xué)特征和ITS片段測(cè)序相結(jié)合的方法進(jìn)行鑒定，以期探索口蘑科真菌的準(zhǔn)確鑒定方法，為真菌開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料來(lái)源

供試標(biāo)本CFSZ10080、CFSZ10245、CFSZ10305、CFSZ11669，其中，CFSZ11669采自?xún)?nèi)蒙古赤峰市松山區(qū)老府鎮(zhèn)神仙溝風(fēng)景區(qū)，其他均采集于賽罕烏拉國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)。標(biāo)本經(jīng)拍攝生境照片、觀察形態(tài)、測(cè)量數(shù)據(jù)，晾干、編號(hào)，超低溫冷凍處理之后存放于赤峰學(xué)院菌物標(biāo)本室（CFSZ）。

1.2? 形態(tài)鑒定

采用宏觀特征和顯微結(jié)構(gòu)的鑒定方法。宏觀特征采用肉眼觀察、游標(biāo)卡尺測(cè)量等方法，需要測(cè)量供試樣本的新鮮子實(shí)體大小、顏色，菌柄長(zhǎng)度以及直徑，菌蓋直徑。進(jìn)行檢索、比對(duì)、定種;顯微結(jié)構(gòu)在光學(xué)顯微鏡（奧特BED203）下觀察和測(cè)量孢子、擔(dān)子、菌蓋表皮、菌柄表皮菌絲形態(tài)及大小，所有數(shù)據(jù)均測(cè)量20個(gè)，用顯微照相系統(tǒng)（Olympus BX53）拍攝顯微結(jié)構(gòu)相片，孢子測(cè)量Q1（長(zhǎng)寬比范圍）和Q2（長(zhǎng)寬比平均值）。

1.3? ITS鑒定

1.3.1? DNA的提取? 樣品子實(shí)體菌蓋部分經(jīng)研磨稱(chēng)量后，稱(chēng)取30 mg，提取基因組DNA時(shí)使用北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的基因組DNA提取試劑盒完成。

1.3.2? PCR擴(kuò)增? PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀（Eppendorf 5331）上進(jìn)行。

利用引物ITS1/ITS4 PCR擴(kuò)增后，PCR體系為50 μL體系，再1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.3? DNA純化及測(cè)序? 樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Takara膠純化試劑盒純化回收后委托上海生工生物科技有限公司完成測(cè)序。

1.3.4? ITS序列比對(duì)分析? 將已測(cè)得的ITS序列，通過(guò)Chromas軟件進(jìn)行處理，將得到的ITS序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast檢索，從結(jié)果中挑選出同源性較高的ITS序列，利用軟件MEGA 5.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)育樹(shù)的每個(gè)分支的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析以最大似然法進(jìn)行檢驗(yàn)，重復(fù)次數(shù)為1 000次。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，CFSZ10080為黃褐口蘑[Tricholoma fulvum（DC.） Bigeard & H. Guill]，CFSZ10245為鱗柄口蘑[Tricholoma psammopus （Kalchbr.） Quél]，CFSZ11669為銀灰口蘑[Tricholoma argyraceum（Bull.） Gillet]，CFSZ10305為毛邊菇[Ripartites tricholoma （Alb. & Schwein.）P. Karst]。

2.1.1? 黃褐口蘑[Tricholoma fulvum （DC.） Bigeard & H. Guill]? 子實(shí)體中等偏小，菌蓋直徑2.5～3.5 cm，半球形，中間凸起，后平展，黃褐色或酒紅色，邊緣內(nèi)卷，蓋緣平滑，表面光滑，濕時(shí)黏，菌褶稍延伸，濕時(shí)奶白色，干后變?yōu)槿夤鹕?，具橘色色調(diào)，遇KOH變黑，菌肉白色，具蘑菇香味，菌肉遇KOH變紅色，菌柄長(zhǎng)2.2～4.8 cm，粗0.3～0.6 cm，黃棕色，色稍淺于菌蓋，濕時(shí)稍黏，圓柱狀，基部膨大，有白色絨毛，表面光滑，黃色或淡棕色

孢子（4.8～6.2） μm×（3.6～5.3） μm，Q1=1.09～1.67，Q2=1.27±0.18，寬橢圓形，有小尖，表面光滑，無(wú)色，非淀粉質(zhì)，擔(dān)子（19.0～31.0） μm×（5.0～7.2） μm，無(wú)色，棒狀，頂端膨大，具4個(gè)小梗，褶側(cè)囊體和褶緣囊體均無(wú)，菌蓋菌絲無(wú)色，有淡棕色內(nèi)含物，遇KOH變?yōu)榧t棕色，具均勻隔膜，直徑4.8～7.0 μm，菌柄表皮菌絲排列整齊，淡黃色，有隔膜，直徑7.5～12.0 μm。

研究標(biāo)本：內(nèi)蒙古赤峰市巴林右旗（43°12′-

44°28′N(xiāo)，118°11′-120°05′E），賽罕烏拉自然保護(hù)區(qū)，正溝松林地上，CFSZ10080，2013年8月13日，劉鐵志、田慧敏、趙艷龍、吳晶。

該種與紅鱗口蘑（Tricholoma vaccinum）、鱗蓋口蘑（Tricholoma imbricatum）很相似，但是紅鱗口蘑菌蓋邊緣有殘留的菌幕，菌蓋被紅褐色毛狀鱗片[11]，鱗蓋口蘑菌蓋表面不黏，深棕色，密被纖毛狀鱗片[12]。而標(biāo)本CFSZ10080菌蓋紅棕色或黃棕色，菌蓋黏，菌柄淺黃棕色，傷后或老后顏色加深。故鑒定為黃褐口蘑，可食用。

2.1.2? 鱗柄口蘑[Tricholoma psammopus （Kalchbr.） Quél? 子實(shí)體中等偏小，菌蓋直徑2.9～3.9 cm，半球形，中間凸起，后平展，紅褐色，邊緣內(nèi)卷，蓋緣平滑，濕時(shí)稍黏，菌褶稍延伸，濕時(shí)奶白色，干后變?yōu)榧t棕色，菌肉白色，遇KOH變紅色，菌柄長(zhǎng)4.6～5.5 cm，粗1.0～1.2 cm，紅棕色，圓柱狀，基部膨大，有白色絨毛，中實(shí)，干后空，中空，表面具棕色纖毛，傷后或老后顏色變深。

孢子（4.4～7.2） μm×（3.8～5.0） μm，Q1=1.05～1.67，Q2=1.29±0.19，寬橢圓形，有小尖，表面光滑，無(wú)色，擔(dān)子（19～36） μm×（5～6） μm，無(wú)色，棒狀，頂端膨大，具4個(gè)小梗，褶側(cè)囊體和褶緣囊體均無(wú)，菌蓋菌絲無(wú)色，有的具淡棕色內(nèi)含物，遇KOH變?yōu)榧t棕色，具均勻隔膜，直徑4.8～9.6 μm，菌柄表皮菌絲排列整齊，無(wú)色，有隔膜，直徑2.5～6.0 μm。

研究標(biāo)本：內(nèi)蒙古赤峰市巴林右旗（43°12′-44°28′N(xiāo)，118°11′-120°05′E），賽罕烏拉自然保護(hù)區(qū)，榮升白樺林地上，CFSZ10245，2013年8月16日，劉鐵志、田慧敏、趙艷龍、吳晶。

該種與銹色口蘑（Tricholoma pessundatum）、多鱗口蘑（Tricholoma muricatum）、長(zhǎng)根口蘑（Tricholoma nictitans）極其相似，但銹色口蘑、多鱗口蘑菌蓋表皮很黏，菌蓋表皮具膠化的菌絲[12-15]。標(biāo)本CFSZ10245菌蓋無(wú)膠化菌絲，有的具淡棕色顆粒狀內(nèi)含物，主要分布于樺木林，而后三者均與松柏科植物形成共生菌根，多鱗口蘑、長(zhǎng)根口蘑菌柄具較長(zhǎng)的根，嵌入土壤中[15]，且分子鑒定結(jié)果顯示該標(biāo)本與長(zhǎng)根口蘑、多鱗口蘑相似度很低，故鑒定為鱗柄口蘑，可食用。

2.1.3? 銀灰口蘑[Tricholoma argyraceum（Bull.） Gillet]? 子實(shí)體中等偏小，菌蓋直徑2.2～3.8 cm，半球形，中間稍凸起，后平展，白色，具棕灰色纖毛狀鱗片，中間鱗片密集，老后邊緣開(kāi)裂，菌肉白色，厚，無(wú)氣味;菌褶白色，直生或彎生，具短菌褶，從蓋緣發(fā)出，菌柄圓柱狀，長(zhǎng)4.6～5.5 cm，粗1.0～1.2 cm，污白色，基部稍膨大，具細(xì)軟毛有白色絨毛，中實(shí)，干后空。

孢子（5.0～6.5） μm×（2.2～3.6） μm，Q1=（1.4～）1.5～2.0（～2.2），Q2=2.01±0.23，寬橢圓形，有小尖，表面光滑，無(wú)色，中間有一大油滴，擔(dān)子（23.5～30.0） μm×（9.1～10.1） μm，無(wú)色，棒狀，具4個(gè)小梗，褶側(cè)囊體無(wú)，褶緣囊體棒狀，（14.5～28.6） μm×（3.2～6.5） μm菌蓋表皮均由排列整齊、首尾相接的菌絲組成，無(wú)色，菌絲隔膜多，均勻，（17.5～61.5） μm×（4.6～7.2） μm，菌柄表皮菌絲排列整齊，無(wú)色，有隔膜，直徑6.0～7.5 μm。

研究標(biāo)本：內(nèi)蒙古赤峰市松山區(qū)神仙溝風(fēng)景區(qū)闊葉林地上群生，CFSZ11669，2016年9月16日，田慧敏等。

該種與棕灰口蘑（Tricholoma terreum）、雕紋口蘑（Tricholoma scalpturatum）極其相似，3種口蘑在內(nèi)蒙古地區(qū)均有分布，但是棕灰口蘑孢子很大，5.5～9.0 μm，菌蓋具有分化的橢圓形菌絲（14～50） μm×（4.0～15） μm[12，13，16];而銀灰口蘑孢子較小，（5.0～6.5） μm×（2.2～3.6） μm，菌蓋表皮也不具有膨大的菌絲，菌絲細(xì)胞大小為（17.5～61.5） μm×（4.6～7.2） μm。而與雕紋口蘑（Tricholoma scalpturatum）的區(qū)別為銀灰口蘑傷后或老后菌褶不變色，孢子長(zhǎng)橢圓形，長(zhǎng)寬比值大，Q1=（1.42～）1.5～2.0（～2.2），雕紋口蘑菌褶受傷或老慢慢變黃，孢子寬橢圓形，長(zhǎng)寬比較小，Q1=（1.2～）1.3～1.5（～1.7）[16]。因此鑒定為銀灰口蘑[Tricholoma argyraceum （Bull.） Gillet]。可食用，味道鮮味，當(dāng)?shù)厝罕娤矚g采食，并收集加工、鹽漬。

2.1.4? 毛邊菇[Ripartites tricholoma （Alb. & Schwein.） P. Karst]? 子實(shí)體中等偏小，菌蓋直徑2.5～3.7 cm，淺漏斗狀，奶白色，干后變?nèi)馍驕\黃棕色，有1～2圈不明顯的同心環(huán)紋，邊緣具條紋，蓋緣有短絨毛，菌褶土黃色或黃棕色，菌肉及菌蓋表皮遇KOH不變色，菌柄長(zhǎng)2.5～5.0 cm，粗0.2～0.5 cm，稍彎曲，淺肉色，干后黃褐色，光滑，基部具白色絨毛。

孢子（4.8～6.5） μm×（4.1～6.0） μm，Q1=0.95～1.26，Q2=1.10±0.08，橢圓形，近球形，表面有小刺，淡黃色，擔(dān)子（20～26） μm×（5.0～7.2） μm，無(wú)色，棒狀，頂端不膨大，具4個(gè)小梗，褶側(cè)囊體和褶緣囊體均無(wú)，菌蓋由兩種菌絲組成，一種為膨大的菌絲，無(wú)色，具均勻隔膜，直徑12.0～19.2 μm，另一種菌絲具鎖狀聯(lián)合，無(wú)色，直徑5.3～10 μm，菌柄菌絲排列整齊，無(wú)色，膨大，直徑9.6～13.2 μm。

研究標(biāo)本：內(nèi)蒙古赤峰市巴林右旗，（43°12′-44°28′N(xiāo)，118°11′-120°05′E），賽罕烏拉自然保護(hù)區(qū)，榮升白樺林地上，CFSZ10305，2013年8月17日，劉鐵志、田慧敏、趙艷龍、萬(wàn)威。

該種為毛緣菇屬模式種，主要特征：菌蓋白色，具稀疏的長(zhǎng)絨毛，邊緣具剛毛，孢子有小疣，2013年在吉林省延邊和龍市首次報(bào)道，但沒(méi)有描述，此種為內(nèi)蒙古新記錄種[17]。

2.2? rDNA-ITS測(cè)序鑒定結(jié)果

2.2.1? 供試樣品測(cè)序結(jié)果? PCR擴(kuò)增的4個(gè)樣品子實(shí)體DNA的ITS序列，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，CFSZ10080 NCBI登錄號(hào)為MG367245和MG36724546，序列長(zhǎng)度為660 bp左右，CFSZ10245 NCBI登錄號(hào)為MG367243和MG36724544，序列長(zhǎng)度為650 bp左右，CFSZ11669 NCBI登錄號(hào)為MG36724310305，序列長(zhǎng)度為640 bp，CFSZ10305 NCBI登錄號(hào)為MG367241，序列長(zhǎng)度為640 bp左右。

2.2.2? ITS序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析? 將4個(gè)標(biāo)本的ITS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，獲得26個(gè)序列，與供試口蘑科真菌具有較高相似度。

對(duì)4個(gè)樣本CFSZ10080、CFSZ10245、CFSZ10305、

CFSZ11669的ITS序列與26個(gè)相似序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，以Melanoleuca polioleuca為外群。結(jié)果表明，與4個(gè)供試標(biāo)本相似的26個(gè)來(lái)自GenBank最相似的序列共分為2大分支，一支為铦囊蘑屬（Melanoleuca），另一支為口蘑屬（Tricholoma）、香蘑屬（Lepista）、毛邊菇屬（Ripartites），其中CFSZ10305與Ripartites tricholoma聚在一起，結(jié)合形態(tài)特征將標(biāo)本CFSZ10305鑒定為毛邊菇（Ripartites tricholoma）。CFSZ10080與Tricholoma fulvum聚在一起，CFSZ10245與Tricholoma psammopus聚在一起，結(jié)合形態(tài)特征分別鑒定為黃褐口蘑和鱗柄口蘑，二者均屬于口蘑屬（Tricholoma section Lasciva）。CFSZ11669與Tricholoma argyraceum聚在一起，鑒定為銀灰口蘑，屬Tricholoma section Terrea。

3? 小結(jié)與討論

本研究中分子鑒定結(jié)果與形態(tài)鑒定結(jié)果基本吻合，CFSZ10080鑒定為黃褐口蘑，CFSZ10245鑒定為鱗柄口蘑，CFSZ11669鑒定為銀灰口蘑，CFSZ10305鑒定為毛邊菇，其中，毛邊菇為內(nèi)蒙古新記錄種，據(jù)Index of Fungorum統(tǒng)計(jì)，毛邊菇屬目前僅有16種和變種，該屬真菌外形特征似杯傘，但具有黃色、球形、帶刺的孢子[18]。中國(guó)僅兩種，主要在吉林省延邊和龍市[17]，而黃褐口蘑、鱗柄口蘑和銀灰口蘑均為優(yōu)質(zhì)食用菌。本研究為口蘑科真菌的鑒定提供了方法，是內(nèi)蒙古菌物資源的完善和補(bǔ)充，也為優(yōu)質(zhì)食用菌的開(kāi)發(fā)利用提供了依據(jù)。

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