不同產(chǎn)地廣藿香的SCoT分子鑒定

席秀利 胡珊 鄔龍怡 孟鶴

摘要：通過(guò)提取廣藿香[Pogostemon cablin （Blanco）Benth.]DNA，正交設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)體系，篩選獲得廣藿香PCR擴(kuò)增的SCoT引物，應(yīng)用NTsys 2.10e軟件并采用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，對(duì)分布于廣州、陽(yáng)江、肇慶、湛江和海南等共16個(gè)居群的廣藿香樣品進(jìn)行分子鑒定。結(jié)果表明，SCoT引物堿基序列共擴(kuò)增出167條條帶，其中多態(tài)性條帶有108條，多態(tài)百分率占64.7%，各品種間的相似系數(shù)分布在0.69～0.91，不同產(chǎn)地廣藿香分別聚為一類。表明不同產(chǎn)地廣藿香有豐富的遺傳多態(tài)性，且SCoT分子標(biāo)記可以作為不同產(chǎn)地廣藿香的鑒定依據(jù)。

關(guān)鍵詞：廣藿香[Pogostemon cablin （Blanco）Benth.];SCoT;分子鑒定;正交

中圖分類號(hào)：R282? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）02-0084-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.02.019? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

廣藿香為唇形科植物廣藿香[Pogostemon cablin （Blanco）Benth.]干燥地上部分，為“十大廣藥”之一。其味辛，性微溫，歸脾、胃、肺經(jīng)，具有芳香化濁，開胃止嘔，發(fā)表解暑的功效[1]。藥材市場(chǎng)傳統(tǒng)上將廣蕾香分為牌香（廣州產(chǎn)）、肇香（肇慶產(chǎn)）、湛香（湛江產(chǎn)）和南香（海南產(chǎn)）[2]。廣藿香不同產(chǎn)地的分化類型，是適應(yīng)特定環(huán)境的結(jié)果，本質(zhì)上由遺傳變異所決定[3]。目前，真正意義上的道地藥材石牌藿香已經(jīng)不復(fù)存在，經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為肇慶地區(qū)的廣藿香的品質(zhì)與石牌藿香相近，亦供藥用，而海南藿香和湛江藿香不供藥用，主要用于提取揮發(fā)油[4]。為了進(jìn)一步利用廣藿香藥材資源，充分發(fā)揮廣藿香這一著名南藥的價(jià)值，有必要將不同品種廣藿香進(jìn)行區(qū)分。

SCoT（目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性分子標(biāo)記，Start

codon targeted polymorphism）是Collard和Mackill開發(fā)的基于SPAR（單引物擴(kuò)增反應(yīng)）的新的目的基因分子標(biāo)記方法[5]。SCoT標(biāo)記結(jié)合了ISSR標(biāo)記和RAPD標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，操作簡(jiǎn)單，成本低，引物通用，多態(tài)性豐富，可用于分子輔助育種[6]。分子鑒別成為一大趨勢(shì)，目前廣藿香品種鑒定的分子生物研究有RAPD[7]、MSAP[8]、SRAP[9]、ITS[10]、psbA-trnH[11]，然而鮮見有關(guān)SCoT標(biāo)記在廣藿香親緣關(guān)系鑒定中應(yīng)用的研究報(bào)道。因此，本研究將來(lái)自不同產(chǎn)地包括廣州市、湛江市、陽(yáng)江市、肇慶市、海南省等地的廣藿香樣品進(jìn)行SCoT分子標(biāo)記鑒定，以期為廣藿香育種及其藥材質(zhì)量鑒定提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

采集16個(gè)不同產(chǎn)地廣藿香樣品（表1），經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)黃海波副教授鑒定為廣藿香，憑證標(biāo)本保存于香雪制藥有限公司研發(fā)中心。詳細(xì)記錄樣品信息及編號(hào)，用75%乙醇清潔葉表面后保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2? 儀器和試劑

分析天平，離心機(jī)，核酸蛋白測(cè)定儀（Implen Nanophotometer），PCR儀（BIO-RAD），凝膠成像儀（BIO-RAD），超低溫冰箱（Thermo 902-ULTS），電泳儀、電泳槽（BIO-RAD），制冰機(jī)，水浴鍋。

dNTPs、Ex Taq DNA聚合酶、Mg2+、10×Ex Taq Buffer、Loing Buffer（Takala），Maker 3（廣州東盛生物科技有限公司），瓊脂糖（Biowest），Golden View核酸染料（北京博凌科為生物科技有限公司），TAE（50×）[生工生物工程（上海）股份有限公司]，植物基因組提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]，參考Collard等[5]提供的36條SCoT引物序列。

1.3? 方法

1.3.1? 基因組DNA提取與檢測(cè)? 采用天根植物基因組試劑盒提取基因組DNA。用微量紫外核酸儀檢測(cè)DNA濃度和純度。將合格樣品DNA濃度稀釋至20 ng/μL后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2? SCoT-PCR 反應(yīng)體系正交優(yōu)化? 選用L16（54）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表2），對(duì)Mg2+、dNTPs濃度、Ex Taq DNA聚合酶、引物和DNA用量進(jìn)行5因素4水平的正交試驗(yàn)。以廣藿香GZ的DNA為模板，隨機(jī)挑選S12號(hào)引物作為擴(kuò)增引物，反應(yīng)總體積20 μL，含有10×PCR Buffer 2 μL，每處理重復(fù)2次。

1.3.3? SCoT-PCR引物篩選? 根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果選擇最佳反應(yīng)體系對(duì)36條引物進(jìn)行篩選，設(shè)平行組。接著對(duì)篩選后的引物進(jìn)行溫度篩選，在PCR儀上設(shè)定50～60 ℃溫度區(qū)間，即50.0、50.9、52.3、54.0、56.3、58.1、59.3、60.0 ℃ 8個(gè)溫度梯度進(jìn)行退火溫度篩選。然后選擇湛江市、陽(yáng)江市、肇慶市高要區(qū)3個(gè)不同產(chǎn)地的廣藿香DNA為模板，按照上述優(yōu)化的SCoT-PCR體系進(jìn)行SCoT分子標(biāo)記，篩選出多態(tài)性好、條帶清晰的引物。

1.3.4? SCoT-PCR 擴(kuò)增與檢測(cè)? PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物加入2 μL 6×loading buffer，采用2.0%瓊脂糖凝膠，在1×TAE電極緩沖液中，120 V，電泳30 min檢測(cè)條帶，凝膠成像儀下拍照。

1.4? 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，對(duì)清晰且易于辨認(rèn)的條帶采用“0/1”系統(tǒng)記錄其位置，建立SCoT標(biāo)記的0/1矩陣。用NTsys 2.10 e軟件計(jì)算樣品間的相似系數(shù)，并用不加權(quán)成對(duì)算術(shù)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? DNA提取結(jié)果

將提取的所有廣藿香樣品在超微量紫外分光光度計(jì)下測(cè)量其濃度和純度，得到其A260 nm/A280 nm均在1.8～1.9，說(shuō)明其DNA純度高，符合PCR的技術(shù)要求。

2.2? SCoT-PCR反應(yīng)體系正交優(yōu)化結(jié)果

使用引物S12對(duì)反應(yīng)體系優(yōu)化的電泳結(jié)果，參考桂騰琴等[12]直觀評(píng)價(jià)法依次對(duì)結(jié)果多態(tài)性進(jìn)行評(píng)分，條帶數(shù)量豐富、清晰的計(jì)16分，涂布或無(wú)條帶的計(jì)1分，反應(yīng)1～16組體系的平均整數(shù)計(jì)分依次為8、9、15、16、8、9、11、12、10、10、7、9、13、12、14、11分。依照計(jì)分原則，計(jì)算同一水平下各個(gè)因素的平均值Kn（表3）。根據(jù)各因素水平下的得分?jǐn)?shù)據(jù)平均值Kn（K值得分最高）可以確定各個(gè)因素的最適濃度。由表3中的K值可以初步確定5個(gè)因素的最適用量分別為1×PCR buffer，3.0 mmol/L Mg2+，0.30 mol/L dNTPs，0.6 μmol/L Primer，1.25 U ExTaq酶，40 ng模板DNA。但鑒于1.00 U Ex Taq酶與1.25 U Ex Taq酶組評(píng)分不相上下，從經(jīng)濟(jì)角度考慮體系最終確定為1×PCR buffer，3.0 mmol/L Mg2+，0.3 mol/L dNTPs，0.6 μmol/L Primer，1.00 U Ex Taq酶。

2.3? 引物篩選及退火溫度優(yōu)化

以最佳反應(yīng)體系對(duì)36條SCoT通用引物進(jìn)行篩選，重復(fù)2次初篩選出20條引物，進(jìn)行8個(gè)退火溫度梯度篩選，根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度判斷條帶，采用區(qū)間溫度對(duì)篩選的引物進(jìn)行匹配最終獲得在52、56、59 ℃ 3個(gè)溫度擴(kuò)增下的18條引物。其中，S33和S34號(hào)引物的退火溫度梯度電泳結(jié)果。

2.4? SCoT擴(kuò)增的多態(tài)性分析

以湛江市、陽(yáng)江市、高要區(qū)3個(gè)地域差異大的樣品對(duì)退火優(yōu)化后的18條引物進(jìn)行多態(tài)性篩選，最終獲得16條擴(kuò)增帶型完整、清晰、多態(tài)性豐畗的引物（表4）。利用這16條引物對(duì)16份材料進(jìn)行SCoT擴(kuò)增，共獲得總條帶167條，其中多態(tài)性條帶共108條，多態(tài)百分率占64.7%，多態(tài)性比率較高，在分子水平上證實(shí)了廣藿香具有豐富的種內(nèi)遺傳多樣性。S25、S29號(hào)引物對(duì)16份材料SCoT-PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果。

2.5? SCoT標(biāo)記的遺傳相似性及聚類分析

利用NTsys 2.10e軟件構(gòu)建全部材料基于SCoT數(shù)據(jù)的UPGMA樹狀圖。16份材料兩兩之間的相似系數(shù)在0.69～0.91，其中湛江市的Z2與Z3樣品以及肇慶市的Q1與Q2，同廣州市龍洞的P2與N1相似度最高達(dá)0.897。而海南省隆江鎮(zhèn)的樣品N2與其他樣品親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，相似度僅有0.69。以相似系數(shù)0.80為閾值可將16份材料劃分為4組，其中湛江市的3個(gè)樣品和陽(yáng)江市的3個(gè)樣品聚為一支;肇慶市高要區(qū)的3個(gè)樣品與2個(gè)牌香樣品、南香N1、廣藿香GZ則聚為一支;廣藿香GY和南香N2分別單獨(dú)成為一支。由此可見，地域靠的越近的廣藿香樣品相似度較高，且親緣關(guān)系更近，不同產(chǎn)地廣藿香大致聚為一類。說(shuō)明SCoT分子標(biāo)記可以作為不同產(chǎn)地廣藿香的鑒定依據(jù)。

3? 小結(jié)與討論

SCoT標(biāo)記作為一種新型的目的基因分子標(biāo)記，在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)該方法不僅具有操作簡(jiǎn)單，而且重復(fù)性好，同時(shí)引物通用性強(qiáng)。本試驗(yàn)從最初的36條SCoT通用引物中最終篩選出16條清晰、條帶豐富的引物作為不同產(chǎn)地廣藿香SCoT分子標(biāo)記的引物，驗(yàn)證了其穩(wěn)定性及可靠性。篩選的16條SCoT引物擴(kuò)增多態(tài)百分率占64.7%，在分子水平上證實(shí)了不同產(chǎn)地廣藿香樣品具有豐富的種內(nèi)遺傳多樣性。

通過(guò)NTsys 2.10e軟件進(jìn)行相似系數(shù)和UPGMA聚類分析發(fā)現(xiàn)，16份樣品廣藿香的相似度分布在0.69～0.91，而以相似度0.80為界限，所有樣品聚為4支。從聚類分析中可以看到，不同產(chǎn)地廣藿香樣品相似度較高，基本聚為一類。然而同一個(gè)地方培育的不同品種受地理位置影響，親緣關(guān)系更近，相似度高，以同采于廣州市龍洞的牌香P2與南香N1樣品為例，兩者相似度達(dá)到0.897。而產(chǎn)于海南省隆江鎮(zhèn)的N2樣品卻與其他樣品相似度較低，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這說(shuō)明了基因表型可能受到地理位置的影響發(fā)生變化，這與劉玉萍等[3]研究認(rèn)為廣藿香不同產(chǎn)地的分化類型是適應(yīng)特定環(huán)境的結(jié)果，本質(zhì)上由遺傳變異所決定的結(jié)論一致。因此，從結(jié)果分析得知SCoT分子標(biāo)記可以在分子層面上對(duì)不同產(chǎn)地廣藿香進(jìn)行大致區(qū)分，可作為不同產(chǎn)地廣藿香的鑒定依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[M].北京：化工工業(yè)出版社，2015.

[2] 廣東中藥志編委會(huì).廣東中藥志.第2卷[M].廣州：廣東科技出版社，1996.

[3] 劉玉萍，羅集鵬，馮毅凡，等.廣霍香的基因序列與揮發(fā)油化學(xué)型的相關(guān)性分析[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2002，37（4）：304-308.

[4] 林小樺，賀? 紅.廣藿香種質(zhì)資源的研究現(xiàn)狀及存在問(wèn)題[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2005，19（4）：60-62.

[5] COLLARD B C Y，MACKILL D J.Start codon targeted （SCoT）polymorphism：A simple，novel DNA marker technique for generating genetargeted markers in plants[J].Plant Mol Biol Rep，2009，27（1）：86-93.

[6] 熊發(fā)前，唐榮華，陳忠良，等.目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性（SCoT）：一種基于翻譯起始位點(diǎn)目的基因標(biāo)記技術(shù)[J].分子植物育種，2009，7（3）：635-638.

[7] 李? 穎，李勁平.廣霍香道地性的RAPD研究[J].中醫(yī)中藥與中西醫(yī)結(jié)合，2006，22（13）：2027-2028.

[8] 黃潔燕，盧慧娟，熊? 燕，等.廣藿香MSAP分析技術(shù)體系的優(yōu)化及引物篩選[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，30（1）：28-35.

[9] 吳友根，郭巧生，何際嬋，等.正交設(shè)計(jì)優(yōu)化廣藿香基因組SRAP擴(kuò)增體系的研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（4）：18-21.

[10] 張? 英，陳? 瑤，張金超，等.廣藿香ITS基因型與地理分布的相關(guān)性分析[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2007，42（1）：93-97.

[11] 黃潔燕，盧慧娟，謝? 暉，等.基于psbA_trnH序列對(duì)廣藿香與藿香、廣防風(fēng)的分子鑒定[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，30（6）： 683-687.

[12] 桂騰琴，孫? 敏，喬愛(ài)民，等.正交設(shè)計(jì)優(yōu)化果梅ISSR反應(yīng)體系[J].果樹學(xué)報(bào)，2009，26（1）：108-112.