不同離心方法提取及鑒定精漿外泌體的效果比較

郭文彬，張萬松，楊 誠，卞 軍，楊建昆，劉存東，亓 濤，王春艷

0 引 言

外泌體是一種能被機體內(nèi)大多數(shù)細胞分泌的微小膜泡，具有脂質(zhì)雙層膜，直徑大約 30～150nm［1?4］。外泌體不僅存在細胞上清液中，同時也廣泛存在并分布于各種體液包括血液、眼淚、尿液、唾液、乳汁、腹水［5?6］。外泌體富含多種蛋白質(zhì)、脂類、DNA和RNA等重要信息且易與毗鄰的細胞膜發(fā)生融合并將其活性內(nèi)容物釋放到受體細胞［5，7］，以直接或間接的方式影響細胞的生理狀態(tài)并與多種疾病的發(fā)生發(fā)展［7］。正常人精漿是由精子和精漿組成，精漿占精漿占絕大部分的一種黏稠的液體混合物，對生殖有著決定性意義。

目前我們對精漿來源的外泌體研究尚處于初級階段，特別是在男性不育方面，外泌體在生殖過程中精子成熟、頂體反應(yīng)、精卵融合等方面研究較少，及其重要功能作用和機制研究尚不清楚［8］。從成分復(fù)雜的生物液體中如何高效率獲得高產(chǎn)量、高濃度、高純度，并保留其生物學(xué)特性的外泌體，是目前的難點，這與外泌體分離提取方法的選擇密切相關(guān)。有報道聚乙二醇成功應(yīng)用于血清，腎上皮細胞，角質(zhì)細胞等多種人源細胞［9］及干細胞外泌體的提?。?0］。本研究前期實驗亦采用的是聚乙二醇富集精漿來源的外泌體［11］。外泌體的提取方法多樣，超速離心法、ExoPerfectTM?MU法與PEG6000法比較提取外泌體在細胞上清［12］和其他的體液中都有成功的報道［13］，而3種方法比較提取精漿外泌體的應(yīng)用報道較少。本研究比較及鑒定超速離心法、Exo?PerfectTM?MU法及PEG6000法提取的精漿外泌體，為外泌體的研究提供不同的選擇方法。

1 資料與方法

1.1 研究對象收集2017年3月至7月南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院檢驗中心30例正常志愿者的精漿樣本。納入標準：均符合WHO第5版診斷標準［14］；年齡27～38歲；禁欲天數(shù)3～5d。排除標準：樣本液化時間、pH、精子形態(tài)、精漿果糖、酸性磷酸酶、α葡萄糖苷酶等參數(shù)異常。精漿樣本隨機平均分成3份。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準（批準號：2018?0315），所有志愿者均簽署知情同意書。

1.2 主要儀器及試劑SCA精子質(zhì)量分析儀（Mi?croPtic，西班牙），智能超速離心機（Beckman，美國）；納米顆粒跟蹤分析儀（NanoSight，英國）；透射電子顯微鏡（Hitachi，日本）；PEG6000（Sangon，上海）；0.45 μm 和 0.22 μm（Millipore，美國）；電泳儀和電轉(zhuǎn)儀（Bio?Rad，美國），總蛋白提取試劑盒（Beyotime，上海），蛋白濃度測定試劑盒（Beyotime，上海），蛋白濃度測定試劑盒（Thermo?Pierce，上海），兔抗人CD63、TSG101多克隆抗體（abconal，美國），兔抗人Calnex?in多克隆抗體（Bioworld，美國），HRP標記羊抗兔IgG（Ray Antibody，北京），PVDF膜（BioTrace，墨西哥）。

1.3 方法

1.3.1 分離精漿采用SCA精子質(zhì)量分析儀分析液化后的精漿樣本，按前向運動精子率（progressive motility，PR）取其正常指數(shù)的臨床樣本。精漿樣本室溫液化20 min，轉(zhuǎn)移無菌EP管進行低溫4℃，1000×g離心15min去除精子細胞，4℃，12 000×g離心30 min去除小細胞及碎片，取上層精漿待用或-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 精漿外泌體的分離和提?、貾EG6000法：取制備上層精漿2mL，按1∶1與PBS混勻后經(jīng)0.45、0.22 μm濾膜進行濾過，去除粒徑較大的微囊泡，再用 PEG6000 2 ×（16 g PEG6000，5.844 g Nacl溶于100 mL ddH2O）按1∶1充分混合4℃過夜（終濃度為8%PEG6000）。次日取混合液進行4℃，12 000×g離心30 min，取沉淀用PBS重懸混勻，采用低溫超高速離心機100 000×g離心90 min獲取沉淀，經(jīng)過濾的PBS 200μL重懸提取物后，0.22 μm濾膜過濾除菌，-80℃保存?zhèn)溆茫淮脮r，BCA法定量外泌體的總蛋白。②超速速離心法：取經(jīng)0.45、0.22 μm濾膜進行濾過上層精漿2mL，PBS重懸混勻，采用低溫超高速離心機100 000×g離心70 min獲取沉淀，經(jīng)過濾的PBS重懸提取物，再次經(jīng)低溫超高速離心機100 000×g離心70 min獲取沉淀，經(jīng)過濾的PBS 200μL 重懸提取物后，0.22 μm濾膜過濾除菌，待用時，BCA法定量外泌體的總蛋白。-80℃保存?zhèn)溆?。③ExoPerfectTM?MU法：取2mL制備好的精漿至無菌EP管，加入ExoPerfectTM?MU exosome分離純化溶液0.4mL，充分混勻后4℃過夜。次日，低溫4℃，1500×g離心30 min，去除殘余溶液，200 μL經(jīng)過濾的PBS重懸混勻exosome沉淀，待用或-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 透射電鏡法取20～40 μL精漿外泌體沉淀懸液于載樣銅網(wǎng)上，室溫靜置5 min，用濾紙從側(cè)面吸干液體滴加pH=7.0，4%磷鎢酸溶液約10 μL于銅網(wǎng)上，室溫負染5 min。濾紙吸干負染液，白熾燈下烤干約15 min，負染15 min置于透射電子顯微鏡下觀察外泌體形態(tài)并拍照。

1.3.4 Western blot法取外泌體懸液添加上樣緩沖液，95℃，變性10 min，每個上樣孔添加40 μg樣品10%SDS?PAGE凝膠電泳（80 V，30 min；100 V，60 min）分離蛋白，濕法（200 mA，120 min）轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用含5%牛血清白蛋白的TBS液室溫封閉1 h；一抗兔抗人CD63、TSG101 多克隆抗體1∶1000、兔抗人Calnexin多克隆抗體1∶1000分別置于4℃過夜，TBST液洗膜3次，10 min/次，二抗兔抗羊IgG 1∶10 000室溫孵育1 h，TBST液洗膜3次，10 min/次，ECL發(fā)光試劑盒顯影，Bio?Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像。

1.3.5 納米顆粒跟蹤分析取精漿外泌體，經(jīng)0.22 μm濾嘴過濾的無菌水按1∶2500稀釋成1 mL，通過納米顆粒跟蹤分析（Nanoparticle Tracking Analysis，NTA）進行測量分析，計算出精漿外泌體的粒徑和濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析采用GraphPad Prism 7統(tǒng)計軟件進行分析。計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)和標準差（xˉ±s）表示，多組間均值比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊時用LSD?t檢驗，方差不齊時用Dunnett?t檢驗。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基本資料3種離心方法精漿基本參數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 正常志愿者精漿基本參數(shù)（±s，n=10）Table1 Demographic data and semen parameters of the healthy donors in three different groups（±s，n=10）

表1 正常志愿者精漿基本參數(shù)（±s，n=10）Table1 Demographic data and semen parameters of the healthy donors in three different groups（±s，n=10）

變量 超速離心法ExoPerfectTM?MU法PEG6000法pH值體積(mL)形態(tài)正常精子率（%）前精子濃度（mol/L）PR(%)7.57±0.04 4.17±1.05 10.6±1.07 115.0±43.89 42.16±3.75 7.71±1.04 3.87±1.76 11.6±0.18 121.0±50.38 52.16±3.06 7.49±0.89 4.04±1.83 9.6±0.91 109.0±34.89 47.16±1.97

2.2 透射電子顯微鏡結(jié)果透射電子顯微鏡下觀察到3種方法提取的精漿外泌體呈圓形、橢圓形的囊泡，有完整雙層膜包繞，直徑約在30～150 nm之間，內(nèi)部含有低電子密度物質(zhì)。見圖1。

圖1 電鏡下3種方法提取的精漿外泌體形態(tài)Figure 1 Morphology of the seminal plasma exosomes ex?tracted by three different methods

2.3 Western blot結(jié)果超速離心法、ExoPerfectTM?MU法及PEG6000法提取的精漿外泌體均陽性表達CD63、TSG101蛋白，對應(yīng)的精子細胞和提取后的精漿上清成陰性。同時，Calnexin蛋白僅表達精子細胞，精漿外泌體和提取后精漿上清均成陰性。超速離心法外泌體中CD63、TSG101含量最多，其次分別是 ExoPerfectTM?MU 法 、PEG6000 法（P＜0.05）。見圖2。

圖2 3種方法提取精漿外泌體的標志物及含量比較Figure 2 Marker protein level and expression of the semi?nal plasma exosomes extracted by three differ?ent methods

2.4 NTA結(jié)果超速離心 、ExoPerfectTM?MU及8%PEG6000對精漿來源提取物經(jīng)過濾PBS稀釋2500倍后，結(jié)果提示MODE曲線線性流暢，外泌體直徑大小較為集中；粒徑峰值平均值分別為105、102 、115 nm，差 異 無 統(tǒng) 計 學(xué) 意 義（P＞0.05）。PEG6000法提取精漿外泌體的濃度、電鏡下數(shù)量較超速離心法、ExoPerfectTM?MU法均明顯降低（P＜0.01），ExoPerfectTM?MU法離心時間較超速離心法、PEG6000法明顯縮短（P＜0.001）。見表2。

表2 正常志愿者3種方法提取精漿外泌體的濃度比較（±s）Table 2 Concentration,number and centrifugation time of the seminal plasma exosomes extracted by three different methods（±s）

表2 正常志愿者3種方法提取精漿外泌體的濃度比較（±s）Table 2 Concentration,number and centrifugation time of the seminal plasma exosomes extracted by three different methods（±s）

與 PEG6000 法比較，*P＜0.05、**P＜0.01；與 ExoPerfectTM?MU 法比較，＃P＜0.001

方法超速離心法ExoPerfectTM?MU法PEG6000法n 10 10 10濃度(×108/mL)21.20±0.98**19.74±1.45**11.90±1.78電鏡下數(shù)量（n）7.0±1.63*6.0±1.63*4.7±1.7離心時間（min）140±20＃30±5 120±10＃

3 討 論

近些年不同領(lǐng)域?qū)ν饷隗w的研究越來越多，以其表面獨特的 CD63、ALIX、TSG101 等［6，15?17］作為外泌體的存在標志物。因此，本研究采用Western blot法驗證外泌體標志物，并比較超速離心法，ExoPer?fectTM?MU法及PEG6000法外泌體中CD63、TSG101含量。

據(jù)報導(dǎo)，人精漿中也存在納米級的囊泡，前人稱之為前列腺小體［18］，后提出精漿來源的微囊泡稱之為精漿外泌體［19?20］。最新研究表明，人精漿外泌體對弱精子癥中的作用機制［21］及其攜帶的非編碼小RNA有潛在的調(diào)控作用［4］。同時與正常人的對比中發(fā)現(xiàn)，男性少弱精子癥不育患者精漿中的細胞外囊泡存microRNA差異表達譜［22］。本研究前期研究表明，不同正常男性精漿外泌體中存在共同蛋白表達譜，如ACTB、PHGDH、SEMG1、LGALS3BP 等蛋白，并在臨床樣本中證實［23］。為本研究開拓了新思路［24］，也為疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)機制提供新方向［22?23］。

外泌體的提取、純化方法各異，如何能高效的提取外泌體，仍是研究者面臨的一大難題。目前國內(nèi)外對外泌體的提取、純化方法各異且在提取流程，提取純度及背景效率都有各自的優(yōu)缺點，如何根據(jù)實驗所需選擇快速高效率的提取方法已然成為對外泌體進一步研究的基礎(chǔ)。因此本研究對多個臨床樣本分別用超速離心法，ExoPerfectTM?MU法及PEG6000法提取的精漿外泌體，并對其進行鑒定及產(chǎn)量濃度，形態(tài)大小及離心時間進行比較。本研究結(jié)果表明，3種方法所提取精漿外泌體的Wester blot均能檢測到其標志蛋白CD63、TSG101的存在，且不表達精子細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Calnexin蛋白。本研究采用納米顆粒跟蹤分析儀分析其大小和透射電子顯微鏡觀察其形態(tài)背景，發(fā)現(xiàn)都能得到外泌體，均能看到有雙層膜結(jié)構(gòu)且粒徑大小30～150nm，說明3種方法都能成功提取的一定量的外泌體。本研究根據(jù)Western blot檢測到的蛋白及NTA分析得出：①外泌體產(chǎn)量濃度上：在相同量的情況下，傳統(tǒng)的超速離心法最多，其次ExoPerfectTM?MU法，PEG6000法則最少；②電鏡背景方面：均能明顯看得到外泌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)，對電鏡下隨機去5個視野進行計數(shù)分析可得：超速離心法和ExoPerfectTM?MU法無差別，且比PEG6000法多；③粒鏡大小方面：3種方法差異無統(tǒng)計學(xué)意義。超速離心法提取程序多，總耗時長；ExoPerfectTM?MU法操作簡便，用時少；PEG6000法提取因聚乙二醇是親水性極強的聚合物，其良好的水溶性使它能和多種有機物成分具有相溶性，與生物大分子能以脫水或氫鍵方式相互作用形成復(fù)合物沉淀。其本身是一種化學(xué)物質(zhì)，富集提取過程是否會對外泌體本身生物學(xué)功能產(chǎn)生影響則有待深究。

綜上所述，超速離心法、ExoPerfectTM?MU法、PEG6000法均成功提取及鑒定精漿外泌體。超速離心法、ExoPerfectTM?MU法較PEG6000法外泌體的產(chǎn)量較多。在流程和耗時上，ExoPerfectTM?MU法較超速離心法、PEG6000法簡捷方便。根據(jù)不同試驗的實際需要，選擇合適高效的外泌體提取方法尤為重要。本研究對精漿外泌體的提取提供了方法學(xué)上的選擇，為精漿外泌體生物學(xué)功能和機制研究奠定了基礎(chǔ)。