大蒜素對TGF?β1誘導人膽管癌細胞上皮間質(zhì)化的影響及機制

鄭世勤，王曉松，陳 雙，嚴展鵬，張秀華

0 引 言

膽管癌是起源于膽管上皮的惡性腫瘤，在解剖學上分為肝內(nèi)、肝外和肝門部膽管癌。21世紀以來在全球范圍內(nèi)膽管癌的發(fā)病率和病死率呈上升趨勢［1?3］，已成為繼肝癌之后的第二大肝膽系腫瘤［4］。其惡性程度高，約80%的膽管癌發(fā)現(xiàn)時由于進展期或已發(fā)生轉(zhuǎn)移只能行姑息治療［5］，只有10%～15%的膽管癌患者可接受根治性的手術(shù)切除。但由于術(shù)后復發(fā)率較高，5年生存率僅為20%～30%［6］。因此，研究膽管癌患者腫瘤細胞轉(zhuǎn)移機制對膽管癌的治療靶點選擇及預防其復發(fā)至關(guān)重要。有研究表明，上皮細胞?間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial?mesenchy?mal transition，EMT）在膽管癌發(fā)展中起重要作用［7］。已有相關(guān)研究證實轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor beta 1，TGF?β1）能誘導膽管癌細胞發(fā)生EMT［8］。大蒜素是一種從大蒜中提取含硫的天然化合物，其分子式為C6H10OS2，主要包括二烯丙基硫化物、二烯丙基二硫化合物和二烯丙基三硫化合物等?，F(xiàn)代藥理學研究表明大蒜素能抑制多種腫瘤細胞的增殖并誘導其凋亡［9?11］。目前有研究報道大蒜素抗腫瘤效應與核因子?κB（nuclear factor?kappa B，NF?κB）信號通路相關(guān)［12］。本文研究了大蒜素體外處理膽管癌細胞RBE后EMT標志物及NF?κB 的表達，探討了大蒜素對 TGF?β1誘導的膽管癌細胞上皮間質(zhì)化的抑制作用及其機制，以期為大蒜素在抗腫瘤藥物方面的臨床應用提供新的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料人膽管癌細胞RBE，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。大蒜素標準品（江蘇南京道斯夫生物公司，產(chǎn)品批號DASF20170502，20mg/瓶，大蒜素純度 98.5%，使用前用培養(yǎng)基稀釋到所需濃度）；重組人TGF?β1（美國Peprotech公司，0716209?1）；RPMI 1640培養(yǎng)基（（美國Gibco公司）；胎牛血清（（美國Gibco公司）；0.25%胰蛋白酶（美國Gibco公司）；MTT（江蘇海門市碧云天生物技術(shù)研究所）；RIPA細胞裂解液（江蘇海門市碧云天生物技術(shù)研究所）；蛋白預染Marker（美國Fermentas公司產(chǎn)品）；Transwell試劑盒（美國Corning公司）；基質(zhì)膠（美國BD Biosciences公司）；兔抗人Gapdh、Snail、Vimentin、NF?κB（p65）及 p?NF?κB（p?p65）一抗（美國Cell Signaling Technology公司）；鼠抗人E?鈣黏蛋白（E?Cadherin）、N?鈣黏蛋白（N?Cad?herin）一抗（美國Cell Signaling Technology公司）；二抗（美國Cell Signaling Technology公司）；ECL超敏發(fā)光液（美國Cell Signaling Technology公司）。

1.1.2 儀器Class II A2型生物安全柜（美國Lab?conco公司）；細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific公司）；細胞培養(yǎng)皿（美國Corning公司）；CKX31倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；5417R小型臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；小型Trans?Blot轉(zhuǎn)印槽（美國Bio?rad公司）；小型垂直電泳槽（美國Bio?rad公司）；Milli?Q Biocel超純水器（美國Millipore公司）；MH?1微量振蕩器（江蘇海門市其林貝爾儀器公司）；QL?901旋渦混合器（江蘇海門市其林貝爾儀器公司）；BCD?272WBCS冰箱（中國青島海爾公司）；Air concept烘箱（法國Froilabo公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組人膽管癌細胞株RBE于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞長至70%～80%時用胰蛋白酶消化傳代，每2～3天傳代1次，取對數(shù)生長期細胞，將人膽管癌RBE細胞先用無血清培養(yǎng)基饑餓12h，按照空白對照組、大蒜素組（IC50）、TGF?β1組（10ng/mL）及大蒜素+TGF?β1組（IC50+10ng/mL）分組處理RBE細胞。大蒜素的濃度由MTT測得IC50確定。

1.2.2 MTT法選擇大蒜素適宜的濃度取對數(shù)期生長細胞，經(jīng)胰酶消化后用完全培養(yǎng)基重懸成細胞懸液，使細胞濃度為5×104個/mL，將細胞接種到96孔板，每組6復孔，每孔100μL，鋪好板后，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜貼壁，棄去舊培養(yǎng)基，設(shè)置調(diào)零孔、空白對照組及實驗組，其中實驗組均加入含不同濃度大蒜素的10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基，濃度分別為1、5、10、20、40、80、160、320μmol/L，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，培養(yǎng)終止前4 h加入5 mg/mL的MTT 10μL；4 h后，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入100μL DMSO終止反應。在振蕩器振蕩10 min，酶標儀570 nm處檢測A值，最后計算細胞增殖抑制率。公式如下：

實驗重復3次，繪制時間?劑量效應曲線，并用SPSS軟件計算 IC50約為 130.7μmol/L。因此本研究中選擇的大蒜素濃度為130.7μmol/L。

1.2.3 細胞遷移率測定采用細胞劃痕法。取對數(shù)期生長細胞，經(jīng)胰酶消化后用完全培養(yǎng)基重懸成細胞懸液，使細胞濃度為5×105個/mL，將細胞接種到6孔板，待細胞鋪滿板底后，用10μL槍頭垂直標記線劃痕，加入PBS沖洗3遍，去除劃下的細胞，按空白對照組、大蒜素組、TGF?β1組及大蒜素+TGF?β1組分別處理后繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。藥物作用細胞24h后，棄掉培養(yǎng)基，在倒置顯微鏡下拍照，每組重復3次，用Image J軟件計算劃痕愈合面積，各組細胞遷移率公式如下：

1.2.4 細胞侵襲力測定采用Transwell小室法，取24孔Transwell小室于濾膜上方每孔加入稀釋后的基質(zhì)膠（Matrige）80μL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育4 h，使其形成凝膠狀。先將各組細胞饑餓12 h，胰酶消化后，用含1%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基吹打成單細胞懸液并稀釋細胞濃度為1×105個/mL，各組分別加藥處理細胞，取100μL加于上室，下室加600μL含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后取出小室，PBS輕輕潤洗，風干后結(jié)晶紫染色20～30 min，取出后再用PBS洗3遍，風干后拍照，取多個視野拍照并計數(shù)，每組至少重復3次。各組細胞侵襲率計算公式如下：

1.2.5 各組細胞中EMT相關(guān)蛋白及NF?κB信號通路蛋白表達檢測采用Western blot法，取對數(shù)期生長細胞，經(jīng)胰酶消化后用完全培養(yǎng)基重懸成細胞懸液，將細胞接種到6孔板，細胞接種密度為5×105個/孔，待細胞長至80%左右時，各組處理細胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h，置于冰上，用冰冷PBS洗滌3遍后，用細胞裂解液提取細胞總蛋白。用BCA法測定蛋白濃度，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別與兔抗人Gapdh、Snail（1∶1000）、Vimentin（1∶1000）、NF?κB（p65，1∶1000）及 p?NF?κB（p?p65，1∶1000）一抗，鼠抗人E?Cadherin（1∶1000）、N?Cadherin（1∶1000）一抗4℃過夜。加入二抗（1∶10000）孵育2h，洗膜，ECL化學發(fā)光，經(jīng)化學發(fā)光成像儀顯影。

1.3 統(tǒng)計學分析應用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD法（方差齊）或Dunnett′S法（方差不齊），以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 大蒜素對人膽管癌細胞RBE發(fā)生EMT后細胞遷移力和侵襲力的影響與空白對照組相比，大蒜素組24h遷移率降低（P＜0.05），TGF?β1組24h遷移率升高（P＜0.05）；與TGF?β1組比較，大蒜素+TGF?β1組24h遷移率降低（P＜0.05）。與空白對照組的侵襲率比較，大蒜素組降低（P＜0.05）、TGF?β1組升高（P＜0.05）；與TGF?β1組的侵襲率比較，大蒜素+TGF?β1組侵襲率降低（P＜0.05）。見表1。Transwell小室侵襲實驗顯示，大蒜素組穿膜細胞數(shù)目明顯低于空白對照組，而TGF?β1組穿膜細胞數(shù)目明顯多于空白對照組；與TGF?β1組相比，大蒜素+TGF?β1組穿膜細胞數(shù)目顯著減少。見圖1。

表1 各組膽管癌RBE細胞遷移率和侵襲率比較（±s,%）Table 1 The migration rates and invasion rates of RBE cells in different groups（±s,%）

表1 各組膽管癌RBE細胞遷移率和侵襲率比較（±s,%）Table 1 The migration rates and invasion rates of RBE cells in different groups（±s,%）

與空白對照組比較，*P＜0.05；與TGF?β1組比，＃ P＜0.05

組別空白對照組大蒜素組TGF?β1組大蒜素+TGF?β1組n3 3 3 3遷移率28.19 ± 0.66 9.25± 0.36*49.22 ± 0.27*13.91 ± 0.75＃侵襲率33.48 ± 0.04 6.59 ± 0.06*40.21 ± 0.12*9.40 ± 0.05＃

圖1 大蒜素對各組膽管癌RBE細胞侵襲力的影響（結(jié)晶紫染色 ×40）Figure1 Effect of allicin on the invasion rates of RBE cellsin different groups（Crystal violet staining ×40）

2.2 大蒜素對人膽管癌細胞RBE發(fā)生EMT后相關(guān)蛋白及NF?κB信號通路表達的影響與空白對照組相比，TGF?β1組E?Cadherin蛋白表達下調(diào)，N?Cadherin、Vimentin、Snail、NF?κB（p65）及 p?NF?κB（p?p65）蛋白表達上調(diào)（P＜0.05）；大蒜素組E?Cadherin蛋白表達上調(diào)，N?Cadherin、Vimentin、Snail、NF?κB（p65）及 p?NF?κB（p65）蛋白表達下調(diào)（P＜0.05）。與TGF?β1組比較，大蒜素+TGF?β1組E?Cadherin表達升高（P＜0.05），而N?Cadherin、Vimen?tin、Snail、NF?κB 及 p?NF?κB 蛋白表達降低（P＜0.05），見圖2。

圖2大蒜素對各組膽管癌RBE細胞EMT和NF?κB信號通路相關(guān)蛋白表達的影響Figure 2 Effects of allicin on the expression of EMT and NF ?κB signaling pathway related pro?teins of RBE cells in different groups

3 討 論

膽管癌起病隱匿，缺乏典型的癥狀與體征，早期診斷困難，早期治療以手術(shù)為主。根治性手術(shù)切除是膽管癌唯一確切的治療方法，然而在切除腫瘤后許多患者發(fā)生局部和遠處復發(fā)［13-14］。對于晚期膽管癌常以化療為主，但其療效并不確切，并不能有效控制膽管癌的轉(zhuǎn)移。近來，使用中成藥抗腫瘤備受廣大學者關(guān)注［15?16］。長期食用大蒜可以提高機體免疫力，而大蒜素是大蒜提取物的主要成分，其在體內(nèi)體外能抑制多種腫瘤細胞的增殖。本研究以人膽管癌RBE細胞為研究對象，用不同濃度的大蒜素作用后，發(fā)現(xiàn)大蒜素能抑制RBE細胞的增殖，并呈一定的劑量依賴性。

腫瘤患者死亡的主要原因是伴有腫瘤轉(zhuǎn)移，腫瘤轉(zhuǎn)移往往是治療失敗的主要原因之一。EMT是腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素，上皮細胞層與細胞間的接觸失去極性，細胞黏附的破壞，然后發(fā)生細胞骨架的顯著重塑，細胞增加的運動性和侵襲性促進腫瘤轉(zhuǎn)移，同時伴隨上皮細胞標志物E?cadherin表達下調(diào)，間質(zhì)細胞標志物N?cadherin、Vimentin等表達上調(diào)。有研究表明在膽管癌細胞發(fā)生EMT后，細胞中E?cadherin表達下調(diào)，N?cadherin，S100A4和Vimentin表達上調(diào)［17］。這些變化是膽管癌易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的重要因素。本研究結(jié)果顯示大蒜素處理TGF?β1誘導的人膽管細胞癌RBE后，膽管癌細胞的遷移率和侵襲率顯著下降；通過Western blot的方法檢測EMT相關(guān)標志物，結(jié)果表明，與空白對照組和TGF?β1組相比，大蒜素組及大蒜素+TGF?β1組的E?Cadherin表達上調(diào)，而 N?Cadherin、Vimentin及Snail表達下調(diào)，這提示大蒜素可能抑制人膽管癌RBE細胞發(fā)生EMT，從而影響其侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

在腫瘤細胞發(fā)生EMT過程中受到多個信號通路調(diào)控，包括TGF?β、Wnt蛋白、核轉(zhuǎn)錄因子NF?κB、Notch蛋白等［18］。NF?κB與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。一般而言，NF?κB可與人核因子κB抑制蛋白α（IκBα）蛋白緊密結(jié)合，當細胞受到各種胞外刺激信后，IκB激酶被激活，可使IκB蛋白磷酸化、泛素化，然后被降解，導致NF?κB的p65磷酸化轉(zhuǎn)移到細胞核，NF?κB p65與目的基因的啟動子結(jié)合，以促進目的基因的轉(zhuǎn)錄。另外NF?κB可直接激活有效的EMT誘導劑，包括Snail和ZEB因子［19］。Snail是以抑制上皮細胞標志物E?cadherin表達的重要轉(zhuǎn)錄因子，NF?κB可誘導Snail表達，導致E?cadherin表達下調(diào)。為了研究大蒜素抑制人膽管癌RBE細胞發(fā)生EMT的機制，我們采用Western blot的方法檢測NF?κB p65相關(guān)蛋白表達的變化。結(jié)果表明，與空白對照組和TGF?β1組相比，大蒜素組及大蒜素+TGF?β1組的NF?κB p65及p?NF?κB（p?p65）表達下調(diào)。由此可以推斷，大蒜素可能通過阻斷NF?κB信號通路抑制人膽管癌RBE細胞發(fā)生EMT。

綜上所述，大蒜素能上調(diào)E?Cadherin，下調(diào)N?Cadherin、Vimentin、Snail、NF?κB及p?NF?κB，進而抑制人膽管癌細胞遷移與侵襲；同時大蒜素對TGF?β1誘導的人膽管癌細胞EMT也有明顯抑制作用，這可能通過阻斷NF?κB信號通路實現(xiàn)。本研究表明，大蒜素對膽管癌細胞的增殖、遷移和侵襲具有顯著抑制作用，但體內(nèi)實驗和體外實驗的結(jié)果也許并不相同，需要進一步開展動物實驗模型研究確定大蒜素是否能在體內(nèi)也發(fā)揮抗膽管癌細胞作用，從而為大蒜素早期應用膽管癌的治療提供更多依據(jù)。